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目的干眼是免疫炎症介导的常见眼病。其中,干燥综合征(Sj?gren’s syndrome,SS)相关的干眼是一种慢性自身免疫性干眼,属于严重和难治的干眼类型,甚至可继发角膜溃疡或穿孔,造成严重的视力损伤。目前SS相关干眼还没有彻底治愈的方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于其低免疫原性和免疫调节作用已广泛应用于炎性和自身免疫性疾病的治疗,但其在自身免疫性干眼中的作用机制尚不明确。人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)因其低免疫原性、取材方便、容易分离提取、体外增值能力强、伦理学问题少等优点逐渐成为主要的干细胞来源。本研究通过建立体外特异性激活的自体外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼模型,观察hUC-MSCs对自身免疫性干眼的治疗效果并探索其可能的作用机制,为临床上hUC-MSCs应用于自身免疫性干眼的治疗提供理论和实验依据,亦可为其它免疫炎症相关眼病的治疗提供重要的线索。方法1.采用胶原酶-胰酶消化法分离、贴壁培养得到hUC-MSCs,倒置显微镜下观察其形态,待细胞融合度达到80%~90%时消化传代。取生长状态良好的第3代hUC-MSCs,采用RT-PCR法检测MSCs表面抗原分子mRNA表达,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化。2.将27只实验兔随机分组,分为正常对照组(n=9)、干眼组(n=9)和hUC-MSCs治疗组(n=9)。建立体外特异性激活的自体外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼模型,hUC-MSCs治疗组在模型诱导后第2w进行hUC-MSCs耳缘静脉输注,每只兔子每次注射1×10~7细胞(重悬于1m L 1×PBS中),连续注射5天,干眼组输注等体积的1×PBS,正常对照组不做任何处理。在模型诱导前以及诱导后每两周对各组实验兔进行干眼临床检查,观察至第8w,取各组泪腺和结膜组织进行H&E染色,观察其组织病理学改变。采用qRT-PCR检测各组泪腺组织中M1/M2型巨噬细胞表型分子及相关细胞因子的表达。Western blot检测泪腺组织中M2型巨噬细胞表型分子Arg1蛋白表达水平。3.将hUC-MSCs分别与经兔泪腺上皮细胞激活的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和经LPS+IFN-γ刺激的THP-1源性巨噬细胞于trans-well培养体系中分离培养。qRT-PCR检测hUC-MSCs对巨噬细胞极化相关基因mRNA表达的影响;细胞免疫荧光检测THP-1源性巨噬细胞经hUC-MSCs处理后Arg1阳性细胞比例变化;Western blot检测Arg1和M1型巨噬细胞表型分子i NOS蛋白表达水平,以及AKT磷酸化水平(p-AKT)的改变。结果1.分离培养的hUC-MSCs能贴壁生长,呈典型的长梭形,平行或者涡旋状排列,并在体外特定诱导条件下可以分化为脂肪细胞和成骨细胞,免疫表型鉴定显示该贴壁细胞表达CD44、CD73、CD105和CD29,不表达CD45、CD34和HLA-DR,符合MSCs的特征。2.静脉输注hUC-MSCs明显提升干眼模型兔的泪液分泌量和泪膜稳定性,减轻角膜上皮损伤导致的角膜荧光素钠着染。组织病理学检查结果显示hUC-MSCs治疗可以减少泪腺及结膜组织中炎性细胞浸润,减轻组织结构破坏。qRT-PCR检测结果显示,干眼组泪腺组织中M2型巨噬细胞标志物Arg1、CD206、IL-10、TGF-β和IL-4 mRNA表达明显低于正常对照组,而hUC-MSCs治疗显著增加模型兔泪腺组织中M2型巨噬细胞标志物表达,同时抑制炎性介质TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、GM-CSF、MCP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达(均P<0.05)。M1型巨噬细胞表型分子i NOS mRNA的表达在干眼组和hUC-MSCs治疗组间的差异无统计学意义。Western blot检测结果也显示hUC-MSCs治疗后泪腺组织中Arg1蛋白表达显著上调(P<0.05)。3.在体外的trans-well培养体系中,hUC-MSCs可增加干眼模型兔PBMCs中M2型巨噬细胞标志物Arg1、CD206、IL-10和IL-4 mRNA表达,同时降低M1型巨噬细胞标志物i NOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达(均P<0.05),而细胞因子IL-1β和TGF-βmRNA相对表达量在两组间的差异无统计学意义。此外,hUC-MSCs作用后PBMCs中Arg1蛋白水平显著增加(P<0.05)。类似的,qRT-PCR、Western blot以及细胞免疫荧光检测结果显示,hUC-MSCs可以通过旁分泌作用促进THP-1源性M1型巨噬细胞向M2型极化。Western blot检测结果显示LPS+IFN-γ刺激后的THP-1源性巨噬细胞经hUC-MSCs作用后AKT磷酸化水平增加,而给予巨噬细胞10μM PI3K/AKT抑制剂LY294002预处理后,p-AKT水平被显著抑制,同时,被hUC-MSCs增强的Arg1蛋白水平也有所下调(均P<0.05)。结论静脉输注hUC-MSCs能显著缓解兔自身免疫性干眼的临床症状,抑制泪腺炎症,减轻组织结构破坏。这种治疗作用可能部分由于hUC-MSCs在体内调节泪腺局部免疫微环境,诱导巨噬细胞向抗炎表型(M2型)极化,从而实现对泪腺结构和功能的保护。hUC-MSCs可能通过旁分泌作用活化AKT信号通路来促进M2型巨噬细胞极化。