论文部分内容阅读
目的:本实验通过研究补肾经方右归丸SD大鼠含药血清干预大鼠BMSCs的软骨向分化过程,探讨右归丸对BMSCs软骨向分化及有关lncRNA的影响,为后续进一步研究lncRNA在右归丸调控BMSCs成软骨分化中的表观遗传学机制奠定基础,从而阐明中医“肾主骨”理论的分子生物学机制,为中医补肾法促进软骨修复提供一定的现代科学依据,也使中医“肾主骨”理论的科学内涵得到提升,同时也给中医“肾主骨”理论的创新提供了新的途径。 方法:采用全骨髓贴壁筛选的方法获得BMSCs。无菌条件下分离出生4周的雄性SD大鼠的胫骨和股骨,冲出髓腔中的骨髓,获得单个细胞液体,分装到培养瓶中,放入培养箱中行原代培养,等细胞长满瓶底(细胞融合超过80%)时传代。传到第二代(P2),通过细胞形态学观察及流式细胞技术(FCM)鉴定大鼠BMSCs。制作右归丸含药血清,通过MTT办法选出对大鼠BMSCs增值最有利的含药血清浓度。将大鼠P2 BMSCs随机分为对照组A组(H-DMEM完全培养基培养)、成软骨诱导组B组(无血清成软骨诱导液培养)、右归丸组C组(无血清成软骨诱导液中加入右归丸含药血清培养)3组,连着诱导21天后,观察3组细胞在形态上的变化,采用Real time RT-PCR技术检测各组细胞II型胶原mRNA的表达,利用lncRNA基因芯片技术得到不同诱导条件下BMSCs软骨向分化过程中lncRNA的表达谱,通过组和组比较挑出3组中表达均有显著差别的lncRNA(差异倍数不低于2倍,p<0.001),比较挑出的差异表达lncRNA在各组中的表达情况。 结果: 1.体外获得了较高纯度的大鼠BMSCs,贴壁生长,细胞形态单一,呈现长梭状,旋涡样排列生长,流式细胞术结果显示:CD29、CD90高表达,CD34、CD45低表达,契合国际细胞治疗协会关于BMSCs判定的标准。 2.MTT结果显示:10%右归丸血清组的细胞增值明显高于其它各组,说明10%的右归丸含药血清最有利于BMSCs的生长。 3.干预21d后,成软骨诱导组和右归丸组II型胶原mRNA的表达显著高于对照组,成软骨诱导组II型胶原mRNA的表达显著高于右归丸组(p<0.05)。 4.利用lncRNA芯片技术获得了不同诱导条件下BMSCs软骨向分化过程中lncRNA的表达谱,挑选出了5个表达显著上调(XR0072425、XR006236、MRuc007nww、AF187814、XR008107)、4个表达显著下调(MRAK166199、MRAK142743、XR007366、MRAK149231)的lncRNA,它们在右归丸组中上调或下调的改变与成软骨诱导组不同。 结论: 1.右归丸具有促进BMSCs增值的作用。 2.在体外特定条件的诱导下BMSCs能向软骨细胞表型分化,成软骨诱导液联合右归丸含药血清诱导BMSCs软骨向分化的作用不及单独运用成软骨诱导液的作用。 3.XR0072425、XR006236、MRuc007nww、AF187814、XR008107、MRAK166199、MRAK142743、XR007366、MRAK149231可能参与了BMSCs的软骨向分化过程。 4.右归丸可能通过调控XR0072425、XR006236、MRuc007nww、AF187814、XR008107、MRAK166199、MRAK142743、XR007366、MRAK149231的表达来影响BMSCs的软骨向分化。