中国部分白酒大曲红曲霉遗传及生理学多样性的研究

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白酒在中国历史悠久,用酒曲酿酒是白酒的特色之一。白酒的酿造离不开酒曲中微生物的繁殖和代谢。白酒质量的好坏与酒曲中微生物的种类、数量及其生长代谢息息相关。红曲霉(Monascus)是酿造白酒的主要真菌之一。本文以全国十个白酒产地的白酒大曲分离的100株红曲霉为研究对象,选用Ben A(β-tubulin gene)、Ca M(calmodulin gene)和Rpb2(DNA-dependent RNA polymerase II the second largest subunit)序列分别进行系统发育分析,并结合形态学特征来综合鉴定红曲霉的物种,测定了红曲霉各菌株糖化酶、液化酶和酯化酶的活性,评价了各菌株产红曲红色素(Monascus red pigment)的能力,同时对菌株的发酵产物进行检测,判断菌株是否产生对人体有害的真菌毒素—桔霉素(citrinin)和对人体有降血脂作用的洛伐他汀(lovastatin)。以期筛选出性能优良的红曲霉菌株。本研究对白酒酒曲和红曲红色素的生产具有重要的参考和应用价值。主要研究结果如下:1.红曲霉形态和分子系统学分析对部分代表性红曲霉菌株的菌落形态特征进行了描述,并结合显微结构特征,初步鉴定出红曲霉物种信息,再结合分子系统学方法基于Ben A、Ca M和Rpb2序列采用最大似然法(ML)构建系统发育树,鉴定出26株红色红曲(Monascus ruber),66株紫色红曲(Monascus purpureus),另外有8株菌株通过克隆测序结果和多基因系统发育学分析,推测它们可能是杂交种,对于其亲本信息还需进一步研究。2.红曲霉液化酶、糖化酶和酯化酶的测定不同的红曲霉菌株酶活性存在差异。有2株红色红曲,5株紫色红曲,1株疑似杂交种液化酶(α-淀粉酶)活性大于100 U/g,酶活性最高的菌株CASM010达到了240 U/g;22株紫色红曲糖化酶活性大于600 U/g,酶活性最高的CASM042达到了1020 U/g;30株紫色红曲,10株红色红曲,3株疑似杂交种酯化酶活性大于60 mg/g·100h,酶活性最高的菌株CASM070酯化酶活性达到了90mg/g·100h。有2株紫色红曲CASM010和CASM075的液化酶、糖化酶和酯化酶活性较高,液化酶活性分别达到240 U/g、118 U/g,糖化酶活性分别780 U/g、660 U/g,酯化酶活性分别达到了66 mg/g·100h、63 mg/g·100h。3.红曲霉次级代谢产物红曲红色素、桔霉素及洛伐他汀的分析根据红曲霉菌株用大米培养发酵得到的红曲米来评价、分析不同红曲霉菌株产红曲红色素、桔霉素和洛伐他汀的能力。通过对红曲米的目测评价,显示有35株菌产红曲红色素能力较高。对桔霉素合成基因簇的桔霉素合成基因(ct)及其调节基因(ct R)进行PCR扩增。PCR电泳结果阳性的菌株,判定该菌株能够产生桔霉素。结果表明有43株菌能产生桔霉素。对其余电泳结果阴性的菌株的发酵产物红曲米进行HPLC-MS检测,发现有33株菌不产生桔霉素,同时对洛伐他汀HPLC-MS的检测,筛选出不产桔霉素、且产洛伐他汀和红曲红色素能力高的菌株CASM002、004、011、044、067、068、080、083、084、085、086、090共12株。本文以白酒大曲分离出来的100株红曲霉为研究对象,依据形态学、分子系统学和生理学揭示了红曲霉物种和菌株的多样性,并从所研究的红曲霉菌株中筛选出发酵酶活性高、产色素能力高、不产桔霉素、产洛伐他汀的菌株CASM080和CASM90,以期为白酒和红曲产品的生产提供优良菌株。
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