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真核细胞中,微管作为细胞骨架的重要组分参与多种生理活动,例如作为细胞内多种物质的运输轨道,帮助自噬小体等囊泡的转运。微管是一种具有极性的动态变化的结构,其快速生长的一端称为正端,而另一端生长缓慢且较为稳定,称为负端。微管正端由GTP-tubulin组成,侧臂主要由GDP-tubullin组成,且随机分布一些GTP-tubulin残基。微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)主要包括微管正端结合蛋白(+TIPs)和负端结合蛋白(-TIPs)。这些蛋白能够调控微管动态性并介导微管参与多种细胞生物学过程。目前已发现多种+TIPs,其核心成员为EBs蛋白家族。EBs能自主结合到微管正端,调控微管动态变化,且能招募多种其他+TIPs结合到微管正端,但EBs如何被调控还不清楚。相对数目繁多的+TIPs,人们对-TIPs的认识还很局限。CAMSAPs蛋白家族作为一类新的-TIPs能结合在动态生长的微管负端,并通过拮抗Kinesin-13解聚酶的作用来稳定微管负端。此外,CAMSAPs敲降能引发EB1在微管正端分布的改变,但具体调控机制尚无报道。该现象也表明,微管的+TIPs和-TIPs蛋白间存在联系。 基于以上认识,本研究对CAMSAPs与EB1之间的关系展开研究。首先用Pull-down实验发现两类蛋白间存在相互作用,随后通过免疫荧光染色发现CAMSAP2对EB1在微管正端定位的影响最为显著。CAMSAPs通过C端结构域与EB1结合,而EB1的linker区域能抑制EB1特定区域与CAMSAPs的结合。之后,本研究围绕CAMSAP2与EB1展开研究,探寻两者在细胞内的相互影响以及两者互作在细胞内的功能。通过免疫沉淀等生化手段,发现CAMSAP2-EB1互作在胞浆中能够不依赖微管发生,且CAMSAP2在胞内的蛋白含量影响EB1在微管正端的长度。反之,EB1也能帮助CAMSAP2在微管负端的稳定。进一步探寻CAMSAF2-EB1在细胞内的互作位点,用活细胞成像观察到微管正端EB1 comets能够靶向CAMSAP2位点与之发生瞬间碰撞,且CAMSAP2敲降会引起EB1运动方向发生改变。因此,本研究推测非中心体微管很有可能通过该方式与其他微管首尾相连参与胞内功能,为物质的长距离运输提供连续轨道。用自噬过程验证该假设,发现CAMSAP2能够通过与EB1互作来帮助自噬小体的逆向运输。此外,自噬小体膜蛋白LC3能够结合CAMSAP2与EB1。这些结果说明EB1 comets靶向CAMSAP2发生短暂碰撞搭建的“桥”很有可能帮助自噬小体的转运。进一步用活细胞成像实验发现CASMAP2敲降后EB1与LC3的接触频率降低,进一步证实了“EB1-CAMSAP2桥”帮助自噬小体的逆向运输。 综上,本研究揭示了CAMSAP2与EB1的关系、相互影响以及两者在胞内的功能,对理解微管正、负端结合蛋白间的关系以及它们在细胞内的作用有重要的提示意义。