抗生素从发现开始,已经被广泛使用于临床、农业生产和畜牧业等。在抗生素被广泛使用的同时,大量的抗生素被持续不断地排放至环境当中,从而造成一系列的环境问题。微生物的耐药性作为最为重要的问题之一已经成为环境工作者关注的热点。本研究以北京温榆河流域水样为研究对象,调查了环境中E.coli(大肠杆菌)对喹诺酮的耐药情况。其中的工作包括革兰氏阴性菌总DNA的耐药基因分析,耐喹诺酮E.coli的发生率的调查,E.coli耐喹诺酮能力的检测,耐药突变位点分析及E.coli的致病因子检测。在本研究中沿温榆河流域设计了12个采样点,通过PCR与琼脂糖凝胶电泳结合的方法,检测了过夜培养后的滤膜上,革兰氏阴性菌总DNA中对三种抗生素的耐药基因,即抗磺胺类(sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ)、四环素类(tetA、tetB、tetM)、β-内酰胺酶类(TEM)基因。结果表明,磺胺类、四环素类、β-内酰胺类类抗生素的耐药基因在温榆河流域被广泛检出。其中tetM在所有采样点都呈阴性,而1号、6号、8号、19号采样点的耐药基因有部分耐药基因未检出,包括tetA或sulⅢ;但其他采样点5、12、18、20、25、26号,除tetM外全都呈阳性;昆明湖样品位于生活区上游,属于污染较少的区域,耐药菌检出率明显低于其他地区,但除了tetM、sulⅢ,其他耐药菌也有检测出来。从各个采样点耐药基因的检出状况来看,这几种抗生素的耐药基因在温榆河水体中具有一定的发生率和普遍性,其种类并不沿水体流向而增加或减少,可能受多种环境条件的影响。同时,本研究还以总DNA为模板扩增出gyrA基因中喹诺酮耐药决定区域(QRDR),其DNA序列的测序结果用Bioedit软件比对后发现,氨基酸序列只有几个无意突变位点,并没有发现与文献报道相应的耐药突变。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI,前称为NCCLS),大肠杆菌抗左氧氟沙星和加替沙星MIC达到8 ug/mL为耐药,因而我们采用了不含抗生素的平板和含8 ug/mL的喹诺酮平板来培养滤膜上的E.coli,通过平板计数法得知,沿温榆河流域耐LEV的E.coli发生率在2.3%~31.3%之间,对GAT耐药的发生率在0.8%~57.8%之间。为了进一步确认环境中喹诺酮耐药性的发生,我们从各采样点,不同喹诺酮梯度的滤膜上随机筛选了共161株E.coli。E.coli对喹诺酮类抗生素的耐药性分析包括耐药能力检测及突变为点分析两个方面。首先,鉴定E.coli耐药能力,即最低抑菌浓度(MIC)的测定。本文采用琼脂稀释法测定了每株菌对两种喹诺酮的MIC,结果表明,E.coli对第三代喹诺酮LEV的MIC显著高于对第四代喹诺酮GAT的MIC,有两株E.coli对LEV的MIC甚至高达128 ug/mL,而E.coli对GAT也已经有一定的耐药性,MIC最高为32 ug/mL。其次,是对不同耐药水平的E.coli的QRDR突变位点的分析,针对喹诺酮作用的机理,以gyrA基因和parC基因为目标,寻找不同突变位点对E.coli的耐药能力的贡献。突变位点的分析结果表明,gyrA基因中S83L突变的发生具有普遍性,并且有很多发生在MIC非常低的菌株中,而D87N突变则主要发生在LEV耐药菌株中,推测是E.coli耐药的一个关键位点;D87Y主要发生在对LEV的MIC在128 ug/mL和64 ug/mL中,表明该位点可能是E.coli具有很高的耐药能力的关键因子。耐药E.coli中的耐药基因及菌株作为一种环境污染,对各种人类及动物的健康都存在威胁,而E.coli的致病性更加剧了这种污染的危害。E.coli虽然是动物体内的正常菌群,但是部分血清型的E.coli也会致病,导致如泌尿道、肠道感染、腹泻、败血症等疾病。本文采用多重PCR-电泳的方法分析了筛选到的E.coli的致病性基因,结果发现161株E.coli中,31.7%的E.coli含有至少一种致病因子,并且致病因子与耐药性具有相关性:在含致病因子的E.coli中,耐左氧氟沙星达到80.4%,耐加替沙星达到52.9%,很大比例的致病性E.coli具有耐药性。