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乙基对硫磷水解酶(OPH)是第一个研究得比较透彻的有机磷水解酶,与本实验室克隆表达的甲基对硫磷水解酶MPH是完全不同的蛋白,它们的相似性小于20%。为比较甲基对硫磷水解酶(MPH)和乙基对硫磷水解酶(○PH)的异同,本文选取来源于乙基对硫磷降解菌Flavobacterium sp. ATCC27551中的乙基对硫磷水解酶基因(opd)、及甲基对硫磷降解菌Plesiomonas sp. M6和Pseudomonas putida DLL-E4中克隆的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)为研究对象,构建了表达载体pET29a-mpd-dsp-his(M6)、 pET29a-mpd-dsp-his(DLL-E4)、 pET29a-opd-dsp-his(Flavoba cterium sp.),在Escheri-chia coli BL21(DE3)中得表达出带有His-Tag的MPH和OPH。本研究首先确定了酶促反应的终止条件：先用浓盐酸终止,再加pH10的Glycine-NaOH缓冲液显色,大大减少了酶活测定时的误差。其次,对MPH和OPH的酶学性质进行了研究。MPH(M6). MPH(DLL-E4)和OPH的最适温度分别为：30℃、35℃和40℃,且三个酶在4℃时的稳定性最高。MPH(M6)、 MPH(DLL-E4)和OPH的最适pH分别为pH8.5、pH9.0、pH8.5,且在pH7.5-pH8.5的范围内酶活稳定性都较高(MPH(M6)、 MPH(DLL-E4)和OPH分别在pH7.5、pH8.0、pH8.5的缓冲液中放置3小时后剩余酶活都能达到95%左右)。Cu2+和Fe3+对MPH(M6)的酶活有较好的促进作用,Ca2+和Zn2+对MPH(DLL-E4)的酶活有较好的促进作用,Co2+、Ni2+和Zn2+对OPH的酶活有较好的促进作用,较高浓度的EDTA-2Na+(10mM)对三个酶都有较大程度的抑制作用；Co2+、Cd2+和Li+对MPH(M6)的酶活有一定的抑制作用,且Co2+和Cd2+对MPH(DLL-E4)的酶活也有抑制作用,Cu2+对OPH的酶活有一定的抑制作用；此外,较高浓度的咪唑(100mM)和NaC1(0.5M)对MPH和OPH的酶活有影响,应在Ni-NTA亲和层析后将其尽量透析掉。此外,我们确定了一组较好的酶长期保藏的方案：8mg/mL的粗酶与“84”等体积混合后再溶于15%NaCl和10%乙醇中(4℃放置三个月后酶活无损失),可将其应用于加酶餐具洗洁精的生产中,具有很好的生产实践意义。我们还对MPH和OPH的降解谱进行了研究,研究发现三个酶的降解谱都比较广,其中OPH较MPH降解谱更广,但三个酶都不能降解倍硫磷。鉴于倍硫磷的结构和甲基对硫磷非常相似,我们通过Error-Prone PCR的方法对OPH定向进化,筛选到了一株能稳定降解倍硫磷的突变株M3-Q6,在倍硫磷浓度为50mg·L-1的无机盐培养基中,30℃,150r·min-1振荡培养72h,其对倍硫磷的降解率达50%；另外还筛选到五株对乙基对硫磷没有降解能力的突变株；我们将这五株突变株进行了重组表达,验证了其对乙基对硫磷确实没有降解能力；此外我们将六株突变株进行突变位点的分析后发现,发生在OPH蛋白结构表面,且远离蛋白活性中心的突变会使OPH的性质发生较大的变化。