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杂色鲍幼虫的附着变态过程,是其生活史中至关重要的时期。该时期的幼虫敏感而脆弱,死亡率高,直接关系到其种群分布、数量变动。本研究在实验室构建的杂色鲍EST数据库的基础上,采用SMART-RACE技术共成功克隆得到3条胰岛素超家族基因:胰岛素样生长因子结合蛋白4(insulin-like growth binding protein 4,IGFBP4)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth binding protein 5,IGFBP5)和胰岛素样蛋白(molluscan insulin-like peptide,MIRP)基因的cDNA,分别命名为hdIGFBP4、hdIGFBP5、hdMIRP。连同实验室已克隆到的杂色鲍胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth binding protein 7,IGFBP7)(hdIGFBP7),采用实时定量PCR(qPCR)和基因沉默等技术分析上述基因在杂色鲍幼虫附着变态过程中的作用。主要的研究结果如下:1)hdIGFBP4 cDNA全长为584 bp,为无脊椎动物中首次克隆到IGFBP4基因的全长cDNA,该基因序列编码137个氨基酸,包括一个IB结构域(21-100 aa)。预测的氨基酸序列中包含CGCCXXC保守基序,10个高度保守的半胱氨酸残基。同脊椎动物IGFBP4相比较,hdIGFBP4缺少C端保守的TY结构域和中部特异的L区。对杂色鲍面盘晚期幼虫进行hdIGFBP4 RNAi实验结果表明,干扰后的幼虫在4 h内,与空白对照组相比较,死亡率显著升高(P<0.05),附着率显著降低(P<0.05),而浮游率无显著变化(P>0.05)。Real-time PCR分析显示,干扰后hdIGFBP4 mRNA水平与空白对照组相比较,极显著下调(P<0.01),同时,hdIGFBP4的相关通路mRNA表达水平也即显著下降(P<0.01)。2)hdIGFBP5 cDNA全长为921 bp,编码136个氨基酸,包括一个IB结构域(42-121aa)。预测的氨基酸序列中包含CGCCXXC保守基序,11个高度保守的半胱氨酸残基。同脊椎动物IGFBP5相比较,hdIGFBP5缺少C端保守的TY结构域和中部特异的L区。对杂色鲍面盘晚期幼虫进行hdIGFBP5 RNAi实验结果表明,干扰后的幼虫在4 h内,与空白对照组相比较,死亡率极显著升高(P<0.01),附着率极显著降低(P<0.01),而浮游率无显著变化(P>0.05)。Real-time PCR分析显示,干扰后hdIGFBP5 m RNA水平与空白对照组相比较,极显著下调(P<0.01),同时,hdIGFBP5的相关通路mRNA表达水平也即显著下降(P<0.01)。3)hdIGFBP7为实验室已获cDNA全长的基因。该基因cDNA全长为1812 bp,编码239个氨基酸,包含IB结构域(22-88 aa)、KI结构域(89-128 aa)和IGc2结构域(144-223aa)。预测的氨基酸序列中包含CGCCXXC和CGXDXXTYXN 2个保守基序,18个高度保守的半胱氨酸残基。对杂色鲍面盘晚期幼虫进行hdIGFBP7 RNAi实验结果表明,干扰后的幼虫在4 h内,与空白对照组相比较,死亡率极显著升高(P<0.01),附着率极显著降低(P<0.01),附有率极显著升高(P<0.01)。Real-time PCR分析显示,干扰后hdIGFBP7m RNA水平与空白对照组相比较,极显著下调(P<0.01),同时,hdIGFBP7的相关通路m RNA表达水平也即显著下降(P<0.01)。4)hdMIRP cDNA全长为935 bp,编码118个氨基酸,包括一个Insulin-like结构域(39-117 aa)。预测的氨基酸序列中有6个高度保守的半胱氨酸残基。对杂色鲍面盘晚期幼虫进行hdMIRP RNAi实验结果表明,干扰后的幼虫在4 h内,与空白对照组相比较,死亡率极显著升高(P<0.01),附着率极显著降低(P<0.01),而浮游率显著升高(P<0.05)。Real-time PCR分析显示,干扰后hdMIRP mRNA水平与空白对照组相比较,极显著下调(P<0.01),同时,hdMIRP的相关通路mRNA表达水平也即显著下降(P<0.01)。