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目的： 香港海鸥型菌(Laribacter hongkongensis,LH)是2001年于香港首次发现的一种食源性致病菌,该菌主要引起社区性胃肠炎和旅行者腹泻。在早期对香港海鸥型菌进行耐药性研究时未发现其对喹诺酮类抗菌药物耐药,故有研究学者推荐喹诺酮类药物作为治疗该菌感染的首选药物之一。然而随着抗菌药物滥用的持续存在,近几年香港海鸥型菌开始出现对喹诺酮耐药的情况,且耐药性有逐步加重的趋势,但其对喹诺酮的分子耐药机制则不甚明了。本研究从草鱼和虎纹蛙中分离出香港海鸥型菌,并从这些分离株中筛选出喹诺酮耐药株。对筛选得到的喹诺酮耐药株进行药物靶位基因、外排泵作用和质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测和分析,以期全面了解香港海鸥型菌对喹诺酮类耐药的分子机制,为该菌感染者抗菌治疗的用药选择提供实验室依据。 方法： 1.香港海鸥型菌的分离和对喹诺酮类药物的敏感性测定 在2011年3月至9月期间,从广州7个不同的菜市场采集新鲜宰杀的草鱼和虎纹蛙的肠道标本,采用选择性培养基分离、生化鉴定和16SrRNA基因分子鉴定的方法分离出香港海鸥型菌菌株。采用纸片扩散法测定香港海鸥型菌各分离株对5种常见喹诺酮类药物(萘啶酮酸、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星)的耐药情况,同时采用琼脂稀释法测定各分离株对萘啶酮酸和环丙沙星的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),筛选出在这两种方法中均对环丙沙星耐药的香港海鸥型菌菌株作为喹诺酮分子耐药机制的研究对象。 2.耐环丙沙星香港海鸥型菌药物靶位基因突变的检测和分析 用普通PCR的方法扩增香港海鸥型菌环丙沙星耐药株和部分敏感株中的两个药物靶位基因--gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR),并对PCR产物进行测序。测序结果与香港海鸥型菌中已知的gyrA和parC基因序列进行比对,找出耐药株中喹诺酮耐药决定区存在的突变位点,并分析这些突变位点与其耐药表型之间的关系。敏感株的测序结果用于对比分析。 3.耐环丙沙星香港海鸥型菌中主动外排泵作用的检测和分析 采用外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)与环丙沙星(CIP)联合应用的方法检测香港海鸥型菌环丙沙星耐药株的外排泵表型,分析耐药株中是否存在外排泵作用机制。 4.耐环丙沙星香港海鸥型菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测和分析 用多重PCR的方法对香港海鸥型菌环丙沙星耐药株进行质粒介导的喹诺酮耐药基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6’)-Ib-cr和qepA基因)的检测,并将检测结果与其耐药性表现结合进行分析。 结果： 1.本文从广州7个不同的菜市场共采集了614份草鱼和虎纹蛙肠道标本,其中草鱼鱼肠443份,虎纹蛙肠道标本171份。从614份肠道标本中共分离出157株香港海鸥型菌,其中82株分离自草鱼鱼肠,75株分离自虎纹蛙肠道标本,两者的分离率分别为18.51％(82/443)和43.86%(75/171)。经统计学分析后发现,香港海鸥型菌蛙株的分离率显著高于鱼株的分离率(χ2=41.66,P<0.001)。 2.(1)157株香港海鸥型菌对5种常见喹诺酮类抗生素耐药率从高到低依次为:萘啶酮酸40.76%(64/157)、诺氟沙星16.56%(26/157)、环丙沙星15.29%(24/157)、恩诺沙星8.28%(13/157)和左氧氟沙星3.82%(6/157)。 (2)香港海鸥型菌鱼分离株只对萘啶酮酸耐药,耐药率为13.41%(11/82);所有鱼分离株均对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星敏感。而蛙分离株对5种喹诺酮类药物表现出不同程度的耐药性,对萘啶酮酸、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为70.67%(53/75)、32%(24/75)、17.33%(13/75)、34.67%(26/75)和8%(6/75)。 (3)157株香港海鸥型菌萘啶酮酸和环丙沙星的MIC50分别为32μg/ml和0.25μg/ml。 3.(1)从157株香港海鸥型菌中检测出环丙沙星耐药株21株,其中有19株发生gyrA基因突变,突变率为90.47%;18株发生parC基因突变,突变率为85.71%。gyrA基因以双位点突变为主,其中有9株发生T85I+D89N突变,有6株发生T85I+D89G突变;15株gyrA基因双位点突变耐药株对环丙沙星的MIC50和MIC90均为32μg/ml,4株gyrA基因单位点突变耐药株对环丙沙星的MIC50和MIC90也均为32μg/ml。parC基因发生S83R+R231C双位点突变的有9株,发生S83R单个位点突变的也有9株。90.48%的耐药株(19/21)gyrA和parC基因中含有两个或两个以上突变位点。有两株耐药株(W66和W68)的gyrA和parC基因均没有发生突变。 (2)在CCCP浓度为0.1μg/ml条件下,21株环丙沙星耐药株外排泵表型检测结果均为阴性。 (3)常见质粒介导的喹诺酮耐药基因在21株对环丙沙星耐药的香港海鸥型菌中只检测出aac(6)-Ib-cr基因,其他的PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD和qepA)均未检测出。aac(6)-Ib基因阳性株有11株,阳性率为52.38%(11/21);而aac(6)-Ib基因阳性株中有9株发生aac(6)-Ib-cr基因突变,突变率高达81.82%(9/11)。 结论： 1.香港海鸥型菌能从淡水草鱼和虎纹蛙中分离得到,且虎纹蛙中香港海鸥型菌的分离率高于草鱼中的分离率。 2.在所检测的5种喹诺酮类抗菌药物中,香港海鸥型菌分离株对萘啶酮酸耐药率最高,对左氧氟沙星耐药率最低。鱼分离株和蛙分离株的耐药谱不同,蛙分离株对喹诺酮类药物的耐药情况比鱼分离株严重。 3.香港海鸥型菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制是靶位基因gyrA和parC基因多位点突变,gyrA基因的主要突变位点是T85I、D89N和D89G,而parC基因的主要突变位点是S83R和R231C。质粒介导的喹诺酮耐药基因aac(6)-Ib-cr的获得可能在耐药发生中起到一定的作用。