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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种猪的高度接触性传染病,不同年龄、品种和性别的猪均能感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征[1-2] ,自1996年郭宝清[3]在中国首次分离到PRRSV后,该病在国内呈蔓延之势。从2006年5月开始,我国南方地区猪群中发生以病猪体温升高、皮肤发紫和呼吸急促等为主要临床症状,剖检变化以弥散性、出血性间质肺炎、淋巴结和各内脏器官不同程度出血为主要特征的疾病。该病的暴发与流行给我国养猪业带来了巨大的经济损失。起初其病因不明,故按其症状特征称之为“高热病”,后来通过大量的流行病学调查、病原分离鉴定证实:本病的主要病原是高致病性猪蓝耳病病毒变异株(Highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)。本研究通过对广东省数个地区多个猪场的病理样本进行检测,分离鉴定不同地区猪场的PRRSV毒株,从而探讨PRRSV在广东省不同地区的流行情况,以及当中PRRSV变异(缺失)株及PRRSV经典(非缺失)株的存在和流行情况;并对分离得到毒株进行Nsp2、ORF3、ORF5基因的克隆与序列分析,以研究这些毒株的分子遗传关系;对广东省PRRSV变异强毒株(GDYF)全基因序列进行分析,以研究PRRSV流行株毒力及其与国内PRRSV毒株的分子遗传间的关系。本研究的主要内容和结果如下:1.对采自广东省的云浮、恩平、四会、广州、佛山、深圳等12个地区猪场的161头发病猪的血清、肺脏处理物、脾和淋巴结混合处理物共278份样品通过RT-PCR进行PRRSV检测,同时将这些样品处理后分别接到Marc-145细胞分离病毒。结果表明:本研究所调查的161头发病猪中有88头感染PRRSV,总阳性率为54.7 %;有65份样品在Marc-145细胞上分离到PRRSV,RT-PCR方法确定所分离的PRRSV均为美洲型,说明广东省美洲型PRRSV的感染严重;其中血清样品的的检出率和分离率最高,肺脏次之,脾和淋巴结的比较差。另外,在广州和四会的同一个地区,同时分离得到了经典PRRSV和变异型PRRSV,表明广东省PRRSV以经典(非缺失)PRRSV和变异(缺失)PRRSV两种类型存在,其中主要以变异株流行为主。2.对分离得到的17个广东省PRRSV流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因进行序列分析。结果表明:分离株中除GDGZ3和GDSH1株没有发生缺失外,其余15株毒株的Nsp2基因均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置为第482位和533～561位氨基酸,这与HP-PRRSV株JXA1的主要特征相符合;且这15个PRRSV变异株与HP-PRRSV株JXA1、GD、HUN4、HUB1、HEB1以及本实验室分离的Henan-1的ORF3、ORF5基因的核苷酸序列推导氨基酸的同源性较高,与标准株ATCCVR-2332、疫苗株RespPRRSMLV株的同源性较低;而GDGZ3和GDSH1株与RespPRRSMLV、ATCCVR2332的核苷酸序列和推导氨基酸的同源性较高,与HP-PRRSV株JXA1株等的同源性较低;依据Nsp2基因所建立的遗传进化树分析,可以发现15个PRRSV变异株间的亲缘关系很近,且都与HP-PRRSV株JXA1、GD、HUN4、HUB1、HEB1和Henan-1株的亲缘关系较近,说明广东省云浮、深圳等地区的PRRSV流行株可能由同一毒株演化而来;而GDZC3与ATCCVR2332、RespPRRSMLV株的亲缘关系较近,说明这毒株可能是RespPRRSMLV株演化而来的,GDSH1与国内疫苗株CH-1a株同源性很高,亲缘关系较近,推测这毒株是由CH-1a株演化而来。3.采用RT-PCR分段扩增广东省PRRSV流行株GDYF的基因组,参照VR-2332序列,根据各片段之间互相重叠的区域,将扩增片段的序列依次拼接获得GDYF株完整的全基因组,并通过DNA star软件对其进行分析。结果表明:GDYF株的Nsp2区域发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失的位置为第482位氨基酸和533～561位氨基酸,与HB-1(sh) /2002相比,Nsp2的第481位氨基酸由D突变为E;GDYF株与HP-PRRSV株JXA1、GD、HUB1、HUN4、HEB1、Henan-1和HB-1(sh)/2002株的各个阅读框氨基酸序列同源性在96.8%~99.2%;与VR2332、RespPRRS MLV和CH-1a株的Nsp2推导氨基酸同源性在75.8%~87.4%。由遗传系统发育树可知,与2006年以后的HP-PRRSV株对比,GDYF与JXA1株的亲缘关系较近;与2006年以前分离的PRRSV毒株对比,GDYF株与HB-1(sh)/2002株的亲缘关系较近,有研究已证明JXA1株是由HB-1(sh)/2002演化而来,由此可以推测GDYF与JXA1株有可能由同一毒株HB-1(sh)/2002演化而来。GDYF与HP-PRRSV株JXA1等参考毒株对比其ORF1a、ORF1b、ORF5基因的推导氨基酸上也存在点的突变。