论文部分内容阅读
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题。以含Na2CO3和NaHCO3为主的碱性土壤抑制水稻的生长发育并制约水稻产量的提高。选育耐盐碱性的水稻新品种是开发利用盐碱地最经济有效的途径之一。差异表达基因克隆与表达cDNA-RAPD和Northern blot方法为揭示水稻耐Na2CO3（NaHCO3）的分子机制提供了新手段。 水稻是中度耐盐碱作物。水稻对Na2CO3（NaHCO3）胁迫适应的基因表达与相关基因的克隆研究将为耐盐碱性水稻转基因分子育种提供指导。因此，本文以粳型水稻品种（Oryza sativa L.）日本晴为材料，首先比较了萌发期和苗期不同浓度的NaC1、NaHC3及Na2C3和pH胁迫下对种子萌发和幼苗生长的影响及中性红根尖染色情况。进一步分析了在不同浓度、处理时间和pH胁迫下，几个相关基因如CA（carbonateanhydrase）、HSP90、PEPCase、NADP-MEl、NADP-ME2、PM-H+-ATPase、V-H+-ATPase、FB8（mitochondria ATPase 6kD subunit）、FB24（APx）、FB37(thioredoxin和FB38（UDPG-glucuronyl transferase）在根、叶中转录样式。并利用cDNA-RAPD法克隆了2个NaHCO3（Na2CO3）胁迫诱导基因甲硫氨酸合成酶基因（MetE）和核糖体大亚基蛋白基因（rpL16）。主要结果如下： 1．不同pH的H2O、NaC1、NaHCO3和Na2CO3逆境胁迫影响种子萌发和生长。在pH5.00-8.50下，种子萌发势较高。吸胀后萌发时根系较地上部更耐NaC1胁迫，对NaHCO3和Na2CO3胁迫较敏感，幼苗生长对胁迫敏感程度为Na2CO3>NaHCO3>NaC1。从根重和茎重表现看，胁迫的临界浓度为NaC1(160mmo1.1-1，pH7.00)，NaC1(140-160mmo1.1-1，pH8.50)，NaC1(120mmo1.1-1，pH10.50)，NaHCO3(60-80mmo1.1-1，pH8.50)和Na2CO3(30mmo1.1-1，pH10.50)。 2．不同浓度的NaC1、NaHCO3和Na2CO3胁迫对发芽后10d幼苗生长的影响相对较小。主要表现在逆境胁迫通过综合影响根、茎生长而抑制幼苗生长。根系胁迫较地上部严重，胁迫处理6d后，差异表现明显。 3．萌发期NaC1、NaHCO3及Na2CO3胁迫处理幼苗6d后，根尖横切面中性红染色实验表明。随胁迫程度加深，根尖酸化加重，伸长区染色较成熟区深，染色部位主要集中于外皮层厚壁组织，内皮层和中柱，皮层薄壁细胞染色较浅。这与伸长区代谢活性和离子转运等有关。 4．苗期不同时间胁迫下，基因在根、茎叶转录分析表明。在叶中，FB8基因转录在NaHCO3胁迫6h较对照增加了1.61倍，随后稳定增加。FB24基因转录以处理48h最高，较对照增加了3.05倍。FB38基因转录在处理12h增加了3.41倍。FB37基因转录随胁迫时间延长而下降。PEPCase基因转录较弱，并受胁迫时间的微弱诱导。HSP90基因转录在胁迫处理48h后较对照增加了2.48倍，CA基因转录随胁迫延长而明显下降，环矿一TPase基因转录较尸八夕二矿一TPase下降快，瓦搜刀尸-初叨了基因转录增加，NADP砌听2转录降低;在根中，入只刀尸初崛了基因不转录，入城刀尹初它2转录增加，CA转录明显增加，厂召了8和为悠尸夕口基因转录也迅速增加。 5.苗期不同浓度胁迫下，基因在根、叶中转录分析表明。在叶中，从妒夕口转录随NaCI胁迫浓度升高而提高，但过高浓度NaHCO3和NaZCO3抑制其转录。CA基因转录与月啄尸夕口转录相反，以NaZCO3处理转录最强;在根中，卢万8转录变化较小，FB了8基因转录以NaZCO3处理较NaCI处理增加，入只刀尸价在刃和尸石尸Case转录受NaCI诱导，而受高浓度NaHCO3和NaZCO:抑制。 6.苗期不同pH胁迫下，基因在根、叶转录分析表明。在叶中，FBS基因转录随PH升高而增强。侧基因以NaCI（pH8.50）、NaHCo3印Hlo.50)和N处CO3（pH4·50、pH6.50）转录较高，FB刃基因转录以NaHCO3处理明显增强，FB了8转录以NaZCO3处理转录最高，FB24转录以NaHCO3和NaZCO3处理高于NaCI处理。月百尸卯基因随NaCI处理pH升高而诱导表达，而随NaHCO3和NaZCo:处理pH升高而降低转录;在根中，FBS基因转录随NaCI和NaZCO3胁迫处理pH升高而增加。FB24基因转录在pH6.50和pH8.50的NaHCO3和NaZCO3处理较高，在PHID.5时转录降低，这与万万24基因编码蛋白清除活性氧水平受胁迫程度影响有关。尸百护凸s。、了去宝尸9口、CA和FB了夕基因转录均受高pH的NaHCO3胁迫而增强，表明它们在水稻适应碳酸钠逆境胁迫的pH调节中具有重要作用。 7.受碳酸钠诱导表达B”一万克隆cDNA序列全长为2740bP，编码765氨基酸，在水稻基因组中以低拷贝存在。与人抢占e川b今anthemum哪rallinun:（U84889），catllararanthus roseus（x83499）甲硫氨酸合成酶伍伦tE)基因编码氨基酸序列的同源性分别为92%和83%;FB4口克隆cDNA序列全长为742bP，推测的氨基酸序列为182个，与拟南芥和烟草的核糖体大亚基蛋白基因。，去了耐编码的氨基酸序列高度同源，在NaCI和NaZCO3胁迫下，在根、叶中转录不同。 8.本文还就水稻碳酸钠胁迫下根尖过酸化及其意义，HZO:对作物耐盐性的影响，逆境蛋白HSP90的诱导，甲硫氨酸合成酶作用，耐碳酸钠的代谢机理进行了讨论。