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右旋糖酐（Dextrans）是一些乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）生长代谢过程中产生的一种胞外多糖（Expolysaccharides,EPS）,具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化及降胆固醇等生物学功能,可作为增粘剂、稳定剂、乳化剂和胶凝剂等广泛应用于食品、化工和医药等领域,然而关于LAB右旋糖酐生物合成机制的研究却十分有限。本研究以实验室前期从发酵食品中分离得到的高产右旋糖酐菌株肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）DRP105为出发菌株,鉴定其右旋糖酐蔗糖酶生物合成相关基因,探究右旋糖酐蔗糖酶的结构和功能,以期阐明肠膜明串珠菌右旋糖酐生物合成的机制。第一,利用单分子Pac Bio测序技术对肠膜明串珠菌DRP105进行全基因组测序,筛选右旋糖酐蔗糖酶调控基因,并利用实时定量荧光PCR（Real Time PCR,RT-PCR）技术验证基因的表达情况。菌株基因组总长为1815345 bp,由1个完整的染色体和5个完整的质粒组成,含有12个r RNA、71个t RNA和24个串联重复序列。染色体中共预测出140个碳水化合物活性酶,1804条信号肽序列。筛选得到三个右旋糖酐蔗糖酶基因dsr A、dsr B和dsr C,其中蔗糖能够显著诱导dsr C表达,dsr C是调控右旋糖酐合成的关键基因。酶蛋白二级结构预测表明,Dsr-C含有17.07%的α-螺旋,29.55%的β-折叠,10.18%的β-转角,43.20%的无规则卷曲,以及四个基本结构区域,符合一般右旋糖酐蔗糖酶的结构特征。第二,利用同源双交换技术成功构建肠膜明串珠菌DRP105 dsr C基因缺失突变菌株,对比分析突变株和野生菌株在代谢物水平的差异,探究菌株的代谢网络特征。结果表明,当以蔗糖为唯一碳源时,突变株中有机酸含量高于野生菌株,右旋糖酐产量以及游离氨基酸含量低于野生菌株。当以葡萄糖为唯一碳源时,突变株和野生菌株代谢物的种类及含量无显著差异（P＞0.05）。肠膜明串珠菌DRP105右旋糖酐的生物合成主要由Dsr-C催化调控。第三,利用基因克隆技术成功构建dsr C过表达菌株,获得重组右旋糖酐蔗糖酶蛋白。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodcyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophphoresis,SDS-PAGE）技术鉴定该重组酶的分子量约为170 k Da。酶的最适p H值为5.5,最适反应温度为30℃。Hg2+、Pb2+、Cu2+、Cr3+、Al3+、Ni2+、和Fe3+抑制酶活,Ca2+显著促进酶活。有机溶剂、表面活性剂和抑制剂抑制酶活,浓度越高,抑制作用越强。圆二色（Circular Dichroism,CD）光谱、激光拉曼（Raman）光谱和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FT-IR）结果表明,该右旋糖酐蔗糖酶是以β-转角和无规则卷曲为主要构件的酶蛋白。第四,利用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析及Sephadex G75凝胶过滤层析等方法,分离纯化天然肠膜明串珠菌DRP105右旋糖酐蔗糖酶,研究酶的结构和性质。SDS-PAGE及液相色谱-二级质谱联用（Liquid Chromatograph-mass Spectrometer/Mass Spectrometer,LC-MS/MS）技术鉴定该酶的分子量约为170 k Da,且基因序列与dsr C序列相似性最高,达到92%。酶的最适p H值为5.5,最适反应温度为30℃。Hg2+、Pb2+、Cu2+、Cr3+、Al3+、Ni2+和Fe3+对酶有较强的抑制作用,低浓度Na+、Li2+、Zn2+、Co2+、Sn2+、Mn2+和Mg2+有促进作用,Ca2+显著促进酶活。有机溶剂、表面活性剂和抑制剂对酶有抑制作用。Km值为0.61 m M,Vmax为3.73 U/mg,酶对蔗糖有较高的亲和能力。该酶同样是以β-转角和无规则卷曲为主要构件的酶蛋白。天然肠膜明串珠菌DRP105右旋糖酐蔗糖酶的结构和性质与重组右旋糖酐蔗糖酶无显著差异。第五,利用重组右旋糖酐蔗糖酶体外成功合成分子量为9.85×10~7 Da的右旋糖酐。FT-IR和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）结果表明,该右旋糖酐是由α-（1→6）糖苷键连接而成的高度线性葡聚糖,没有分枝结构,不同与天然右旋糖酐。酶法合成的右旋糖酐呈片状、紧凑结构,具有较高的热稳定性、持水性和溶解性,能够增强牛奶凝结,促进益生菌增殖。综上所述,本研究联合利用多种生物学技术探究肠膜明串珠菌DRP105右旋糖酐蔗糖酶结构功能特性及右旋糖酐生物合成机理。结果表明,dsr C是右旋糖酐合成的关键基因,该基因表达的右旋糖酐蔗糖酶催化产生无分枝结构的右旋糖酐,不同与天然右旋糖酐,可能是肠膜明串珠菌DRP105右旋糖酐生物合成过程中受菌株来源、发酵条件等因素影响,以及在蔗糖代谢过程中受其他酶的催化调控影响。本研究结果为进一步揭示LAB右旋糖酐的生物合成机制提供理论基础,为右旋糖酐的构效关系研究提供科学依据。