腭裂是人类常见的出生缺陷之一,腭裂引起的进食、吞咽等一系列功能障碍,会对患病者的家庭造成一定程度的经济和精神负担,也会给患者的生活和心理上带来负面影响。腭裂作为一种复杂的先天性疾病,基因和环境等因素均可以诱发腭裂,然而腭裂的具体发病机制至今尚不明确。2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-Tetrachlodibenzo-p-dioxin,TCDD)是二噁英类化合物中毒性最强的一种,作为一种环境内分泌干扰物,TCDD可通过环境和食物在动物及人体内蓄积,并可通过胎盘屏障,导致胎儿出现腭裂、肾积水等出生缺陷。但TCDD诱发胚胎腭裂的具体机制尚不明确。TCDD主要通过激活芳香烃受体(aromatic hydrocarbon receptor,AhR)途径发挥毒性作用,同时TCDD也可以影响体内维生素A的代谢。八聚体结合转录因子(Octamer-bingding transcription factor 4,Oct4)作为一种胚胎特异转录因子,在抑制细胞分化、维持干细胞多潜能中有重要作用。Oct4可通过激活增殖相关因子,参与多能细胞信号传导,并能诱导体细胞去分化,激活组蛋白去甲基化酶参与表观遗传调控。Oct4也参与了维甲酸(retinoic acid,RA)诱导的分化作用,此外Oct4与AhR之间存在有交互作用。有研究表明,Oct4与腭裂有生物学相关性,且Oct4 5’端有AhR和维甲酸受体(RAR)结合元件。在本研究前期阶段发现TCDD可以抑制胎鼠腭突组织中Oct4的表达,提示Oct4可能参与TCDD诱发胎鼠腭裂。本研究通过采用TCDD诱发胎鼠腭裂模型以及胎鼠腭突间充质细胞原代培养模型,从动物实验和细胞实验两个方面研究TCDD诱发腭裂的相关机制以及Oct4在其中的重要作用,从而为腭裂机制研究、疾病预防提供理论及实验依据。目的1.采用腭裂动物模型和胎鼠腭突间充质细胞体外培养模型,观察体内外TCDD对腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响。2.通过检测RA信号途径关键信号分子的表达,探索TCDD对RA信号途径的影响。3.通过分析胎鼠腭突间充质内Oct4的表达以及其与RA信号分子结合情况,探索Oct4在TCDD诱发腭裂中的作用机制。4.通过检测小鼠暴露于TCDD后胎鼠腭突发育关键时期Oct4基因启动子区DNA甲基化水平,以进一步探讨TCDD诱发腭裂的可能机制。材料和方法1研究对象本研究选用C57BL/6N近交系小鼠及小鼠胚胎腭间充质细胞为研究对象,SPF级C57BL/6N小鼠通过雌雄交配合笼,获得孕鼠,将查到阴栓当天标记其妊娠天数(gestation day,GD)为GD0。体内动物实验使用GD13、GD14和GD15胎鼠。体外细胞实验则使用GD13胎鼠制备胚胎腭间充质细胞。2方法2.1体内实验2.1.1将所得孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组孕鼠按照64 μg/kg·bw的剂量进行TCDD一次性灌胃,对照组孕鼠使用等体积玉米油灌胃。共获得实验组和对照组孕鼠各40只。2.1.2所得的孕鼠在GD13、GD14和GD15时,一部分胎鼠取其胎鼠头部制得石蜡切片,进行HE染色、免疫组化以及BrdU和TUNEL分析,观察GD13、GD14和GD15胎鼠腭发育,TCDD诱发腭裂的动态过程,以及TCDD对胎鼠腭突间充质增殖和凋亡的影响。2.1.3另一部分胎鼠取其两侧腭突间充质,提取蛋白质,采用Western Blot法检测TCDD对Oct4蛋白RA信号途径主要分子表达的影响。2.1.4采用亚磷酸氢盐测序法检测TCDD对腭突间充质中Oct4基因启动子区甲基化水平的影响。2.1.5免疫共沉淀检测TCDD对胎鼠腭突间充质内Oct4与RAR信号分子蛋白的结合情况。2.2体外实验对GD13胎鼠腭突间充质细胞进行分离和鉴定,进行腭突间充质细胞原代培养,采用CCK8法验检测不同浓度的TCDD在作用24 h,48 h,72 h后对胎鼠腭突间充质细胞活力的影响,免疫荧光以及BrdU和TUNEL法进一步观察TCDD对腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响,qRT-PCR法、Western Blot检测检测TCDD对AhR及RA信号途径主要分子表达的影响。Si RNA和Western blot来检测TCDD对Oct4蛋白表达的影响,以及Oct4基因沉默后,TCDD对CRABPII蛋白表达的影响。结果1.按照64μg/kg· bw剂量TCDD灌胃诱导C57BL/6N胎鼠腭裂时,发生率可达95.9%。HE染色结果显示,对照组胎鼠腭突可正常上抬至水平方向生长,GD 15完成腭突融合。实验组的胎鼠腭突在GD 14时部分出现上抬延迟,GD 15时水平方向的腭突无法接触融合形成明显裂隙。2.免疫组织化学、BrdU和TUNEL免疫荧光以及Western Blot结果显示:在动物实验中,与对照组相比,TCDD可以抑制胎鼠腭突间充质的增殖,促进其凋亡;抑制间充质中增殖相关蛋白PCNA的表达,促进凋亡相关蛋白BAX的表达(P<0.05)。在细胞实验中,TCDD可抑制腭突间充质细胞的增殖和活力,促进间充质细胞的凋亡(P<0.05)。3.qRT-PCR和Western Blot结果显示,TCDD可抑制腭间充质细胞中Oct4、RA信号途径相关分子的表达(P<0.05)。4.免疫共沉淀结果显示,Oct4与RARB、CRABPⅡ蛋白存在结合作用,并且TCDD可以促进这种结合(P<0.05)。5.亚硫酸氢盐测序法结果显示,TCDD在胎鼠腭突发育的关键时期(GD 14)并不改变Oct4启动子区甲基化水平(P>0.05)。6.Oct4siRNA转染腭间充质细胞实验结果显示,Oct4被沉默后,TCDD对CRABPⅡ的抑制作用消失,随着TCDD作用浓度增加,CRABPII表达水平也升高。结论1.TCDD可以抑制胎鼠腭突间充质的增殖,促进间充质的凋亡,这可能是TCDD诱发腭裂的关键机制。2.TCDD在诱发腭裂过程中,可能是通过干扰RA信号途径发挥作用的。3.Oct4可能参与调控TCDD诱发腭裂以及影响RA信号途径。4.TCDD可能不是通过改变GD14时胎鼠腭间充质Oct4启动子区甲基化水平影响相关信号分子表达的。