【摘 要】
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桃蚜Myzus persicae属半翅目蚜科,是世界最重要的农林害虫之一,化学农药的长期使用已经使桃蚜产生严重的抗药性。植物源农药对害虫具有毒力的同时很难使害虫产生抗药性,为化学合成杀虫剂提供了有效的替代品。反式茴香脑trans-anethole是八角茴香、茴香等精油中的主要成分,已有研究表明其对桃蚜有高毒力性。然而,对于桃蚜在分子水平上如何应对反式茴香脑胁迫的研究甚少。本研究利用高通量测序技术对
【基金项目】
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安徽省自然科学基金“反式茴香脑对黄绿绿僵菌杀蚜增效的分子机制研究”（1908085MC94）；
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桃蚜Myzus persicae属半翅目蚜科,是世界最重要的农林害虫之一,化学农药的长期使用已经使桃蚜产生严重的抗药性。植物源农药对害虫具有毒力的同时很难使害虫产生抗药性,为化学合成杀虫剂提供了有效的替代品。反式茴香脑trans-anethole是八角茴香、茴香等精油中的主要成分,已有研究表明其对桃蚜有高毒力性。然而,对于桃蚜在分子水平上如何应对反式茴香脑胁迫的研究甚少。本研究利用高通量测序技术对反式茴香脑亚致死剂量处理48 h后桃蚜三龄若虫和未处理对照组进行转录组测序,利用生物信息学分析工具分析方法分析反式茴香脑胁迫下桃蚜差异表达基因并进行分析,筛选重要的胁迫响应基因,并研究其功能。为进一步利用反式茴香脑开发植物源农药奠定前期基础。主要结果如下:1.反式茴香脑对桃蚜三龄若虫的毒力测定表明,反式茴香脑对桃蚜具有高毒力,选取48h LC50作为处理浓度,浓度3.2 mg/L;2.转录组测序结果3个处理组分别得到4.14×10~7、4.87×10~7、4.69×10~7个原始序列读数（raw reads）;3个对照组分别得到4.93×10~7、4.75×10~7、5.16×10~7个原始序列读数（raw reads）。通过使数据过滤,去除低质量的reads,分别从各处理组和对照组得到3.86×10~7、4.57×10~7、4.4×10~7个有效数据（clean reads）和4.59×10~7、4.53×10~7、4.85×10~7个有效数据（clean reads）。通过将clean reads与参考基因组序列进行比对,得到处理组与对照组平均约有93%能定位到参考基因组上。3.通过处理组与对照组差异基因表达分析得到559差异表达的基因,其中上调基因318个,下调基因241个。通过对差异表达富集分析,在GO数据库559个差异表达基因主要被分为46个功能中;在KOG数据库中有67个差异表达基因本富集到18个代谢途径上。由于对桃蚜抗氧化酶的基因研究较少,挑选出抗氧化酶的基因SOD作为主要研究对象,对其进行后续研究。4.通过NCBI在线查询得到桃蚜SOD信息,通过与其他物种蛋白序列连配,得到桃蚜SOD1蛋白序列有2个Cu/Zn SOD的特异序列43-53 bp（GFHIHEFGDNT）、137-148 bp（GNAGARIACGVI）、7个Cu2+、Zn2+金属结合位点和2个半胱氨（SS）结合位点;桃蚜SOD2蛋白序列有1个Mn SOD的特异性序列183-189 bp（DVWEHAYY）,4个Mn2+金属结合位点;桃蚜SOD3蛋白存在2个Cu/Zn SOD的特异序列71-81 bp（GFHVHEKGDVT）、165-176 bp（GHAGSRVACGVI）,7个Cu2+、Zn2+金属结合位点,表明3种桃蚜SOD在进化过程中的高度保守性。通过进化树分析得到桃蚜3种SOD分别与棉蚜3种SOD以及豌豆蚜3种SOD基因聚为一支亲缘关系较近。5.利用RT-q PCR明确了桃蚜3种SOD基因在龄期表达模式以及在反式茴香脑、温度、紫外线和氯菊酯杀虫剂4种不良环境胁迫下的表达模式,结果表明桃蚜3种SOD基因龄期表达水平随着龄期的增长而升高;以3.2 mg/L反式茴香脑胁迫下,桃蚜3种SOD基因表达水平与对照组相比均显著上调,这与转录测序中差异表达基因相呼应;在不同温度胁迫下,桃蚜3种SOD表达水平与对照组（25）相比0处理条件下表达水平显著上调;在紫外线胁迫下,桃蚜3种SOD基因表达水平,在胁迫1.5h表达水平与对照组（0 h）相比上调最为显著;在20 mg/L氯菊酯杀虫剂胁迫下,桃蚜3种SOD基因表达水平在36 h与对照组（0 h）相比上调最为显著。6.挑选桃蚜SOD1作为主要研究对象。成功构建p Cold II-Mp SOD1质粒,通过SDS-PAGE和Western blott分析结果表明蛋白成功得到表达,利用所含有的His标签与Ni柱结合对其进行纯化,对纯化后的蛋白透析以及酶活性检测,最终得到在大约在15.7 k Da处有一条特异性的条带与目的条带一致,测定出酶活性为1.03 U/mg。7.以浓度为3.2 mg/L反式茴香脑处理桃蚜,48 h后检测Cu Zn/Mn SOD酶总活性,结果表明反式茴香脑引起Cu Zn/Mn SOD酶活性的上升且在72 h上调最为显著,因此反式茴香脑可以对桃蚜造成氧化损伤。8.在大肠杆菌中过量表达桃蚜SOD1的基础上,通过将转化后的重组蛋白p Cold II-Mp SOD1在氧化剂百草枯和H2O2胁迫下分析其抗氧化功能,结果表明含有p Cold II-Mp SOD1重组蛋白的大肠杆菌细胞的存活率明显高于p Cold II大肠杆菌细胞的存活率,说明桃蚜SOD1在抗氧化损伤中有着重要作用。
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