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副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）作为猪上呼吸道的一种常在菌，同时也是格拉瑟氏病的病原，给世界养猪业带来了巨大的经济损失，受到各养猪国家的广泛关注。然而该菌血清型较多，彼此之间毒力差异大，其潜在的毒力因子和致病机理仍未得到充分揭示。因此开展副猪嗜血杆菌毒力因子的挖掘和研究对于该病的综合防控具有重要的意义。本研究以临床分离毒力菌株和无毒菌株为材料，利用双向电泳技术和质谱鉴定技术对菌株的膜蛋白成分进行表达差异分析和鉴定，对筛选出的毒力因子HphtrA利用新构建的遗传操作方法构建htrA基因缺失株，并对其进行毒力相关性鉴定。最后通过分子生物学方法揭示HpHtrA蛋白的功能及其在致病过程中的作用。具体工作如下:
1、HPS毒力与非毒力菌株膜差异表达蛋白筛选
为筛选毒力与非毒力菌株的膜差异表达蛋白，发现和鉴定HPS重要毒力因子，本研究使用双向电泳技术和质谱鉴定技术，对毒力菌株SC-1和非毒力菌株SC105的膜蛋白表达水平进行了比较分析。结果显示，SC-1菌株膜蛋白在SDS-PAGE胶上展示出189±15个蛋白点，而SC105菌株膜蛋白在胶上展示出191±16个蛋白点。进一步分析显示，有9个蛋白点在SC105凝胶图中特异性检测到，有10个蛋白点在SC-1凝胶图中特异性检测到。所有差异表达蛋白点通过MALDI-TOF MS和MALDI-TOFMS/MS获得鉴定。蛋白的差异表达情况通过qRT-PCR从转录水平做进一步的验证。结合鉴定结果和生物信息学分析，HpHtrA是HPS毒力与非毒力菌株的膜差异表达蛋白，并且推测该蛋白是副猪嗜血杆菌的重要毒力因子。
2、副猪嗜血杆菌HphtrA基因缺失株的构建
HtrA蛋白已在多种病原体中被鉴定为一种重要毒力因子。在前期研究中发现，HtrA蛋白在副猪嗜血杆菌毒力菌株中上调表达，其可能参与到该菌的致病过程。为探究其毒力相关性，本研究利用优化的基因缺失方法构建了HphtrA基因缺失株。本研究首先以HphtrA基因左右同源臂和卡那抗性基因构建了自杀质粒pMDHK，利用该质粒通过自然转化法成功从8株野毒菌株中筛选出1株自然感受态菌株SC1401。然后再构建用于正负向筛选的重组自杀质粒pMDHKS和pMDH，以筛选出的自然感受态菌株为亲本，经两次同源重组，获得了靶基因的无抗缺失。本研究在已有的副猪嗜血杆菌自然转化方法基础上进行了创新性改进，通过两次自然转化，可获得靶基因的无抗缺失。本研究成功构建了HphtrA基因无抗缺失株，为HpHtrA蛋白的毒力相关性研究和功能研究提供了生物材料。
3、副猪嗜血杆菌HpHtrA毒力相关性研究
为探究HphtrA的毒力相关性，同时对野毒株和△htrA缺失株的生物学特性进行了比较分析。在37℃条件下，亲本株和△htrA缺失株生长速率无显著性差异。在氧化、高温和PH环境压力试验中，△htrA缺失株相比亲本株对高温更敏感，生长变得迟缓，但在氧化和PH压力条件下生长差异不显著;在自凝集试验中，△htrA缺失株相比亲本株自凝集活性显著增强;在血清杀菌试验中，△htrA缺失株的存活率为2.8％，而亲本株的存活率为75.5％，△htrA缺失株相比亲本株抗血清杀菌能力显著降低;在生物被膜形成试验中，△htrA缺失株相比亲本株生物被膜形成量显著增加;小鼠毒力试验中，在相同攻毒剂量（1.4×109CFU/只）条件下，亲本株感染小鼠全部死亡，而缺失株感染小鼠仅死亡50％，△htrA缺失株相比亲本株毒力减弱。以上研究结果表明，HpHtrA蛋白对于副猪嗜血杆菌完整毒力的发挥必不可少，是该菌的重要毒力因子。
4、副猪嗜血杆菌HpHtrA蛋白酶切与分子伴侣功能研究
为了深入研究HpHtrA的功能，本试验首先表达了具有活性的rHpHtrA及其突变体蛋白，然后进行了一系列的分子伴侣试验和蛋白酶切试验。生物信息学分析显示，HpHtrA由一个N端信号肽序列、一个蛋白酶区和2个PDZ区组成。纯化的rHpHtrA及天然状态下的HpHtrA均表现出两种分子量形式。rHpHtrA同时具有分子伴侣活性和蛋白酶切活性，其突变体蛋白rHpHtrAH113R和rHpHtrAD143V的分子伴侣活性和蛋白酶切活性均显著降低，rHpHtrAS219A的分子伴侣活性和蛋白酶切活性无显著变化，表明His113和Asp143是HpHtrA的活性位点，而Ser219不是。HpHtrA能够保护膜蛋白免于DTT的变性作用，对膜蛋白具有分子伴侣作用。对经HpHtrA处理前后的HPS膜蛋白进行差异分析结合质谱鉴定发现，NikE，DppA和OmpA蛋白是HpHtrA的酶切底物。HpHtrA的蛋白酶切活性具有温度依赖性，功能发挥的最佳温度为40℃，且具有自降解作用。此外，通过双向电泳对亲本株和△htrA缺失株的分泌蛋白进行差异分析发现，HpHtrA不参与胞外蛋白的分泌。本研究更清晰地认识了HpHtrA的蛋白酶切与分子伴侣功能，为以HpHtrA为潜在药物靶点的研究提供了理论基础。
1、HPS毒力与非毒力菌株膜差异表达蛋白筛选
为筛选毒力与非毒力菌株的膜差异表达蛋白，发现和鉴定HPS重要毒力因子，本研究使用双向电泳技术和质谱鉴定技术，对毒力菌株SC-1和非毒力菌株SC105的膜蛋白表达水平进行了比较分析。结果显示，SC-1菌株膜蛋白在SDS-PAGE胶上展示出189±15个蛋白点，而SC105菌株膜蛋白在胶上展示出191±16个蛋白点。进一步分析显示，有9个蛋白点在SC105凝胶图中特异性检测到，有10个蛋白点在SC-1凝胶图中特异性检测到。所有差异表达蛋白点通过MALDI-TOF MS和MALDI-TOFMS/MS获得鉴定。蛋白的差异表达情况通过qRT-PCR从转录水平做进一步的验证。结合鉴定结果和生物信息学分析，HpHtrA是HPS毒力与非毒力菌株的膜差异表达蛋白，并且推测该蛋白是副猪嗜血杆菌的重要毒力因子。
2、副猪嗜血杆菌HphtrA基因缺失株的构建
HtrA蛋白已在多种病原体中被鉴定为一种重要毒力因子。在前期研究中发现，HtrA蛋白在副猪嗜血杆菌毒力菌株中上调表达，其可能参与到该菌的致病过程。为探究其毒力相关性，本研究利用优化的基因缺失方法构建了HphtrA基因缺失株。本研究首先以HphtrA基因左右同源臂和卡那抗性基因构建了自杀质粒pMDHK，利用该质粒通过自然转化法成功从8株野毒菌株中筛选出1株自然感受态菌株SC1401。然后再构建用于正负向筛选的重组自杀质粒pMDHKS和pMDH，以筛选出的自然感受态菌株为亲本，经两次同源重组，获得了靶基因的无抗缺失。本研究在已有的副猪嗜血杆菌自然转化方法基础上进行了创新性改进，通过两次自然转化，可获得靶基因的无抗缺失。本研究成功构建了HphtrA基因无抗缺失株，为HpHtrA蛋白的毒力相关性研究和功能研究提供了生物材料。
3、副猪嗜血杆菌HpHtrA毒力相关性研究
为探究HphtrA的毒力相关性，同时对野毒株和△htrA缺失株的生物学特性进行了比较分析。在37℃条件下，亲本株和△htrA缺失株生长速率无显著性差异。在氧化、高温和PH环境压力试验中，△htrA缺失株相比亲本株对高温更敏感，生长变得迟缓，但在氧化和PH压力条件下生长差异不显著;在自凝集试验中，△htrA缺失株相比亲本株自凝集活性显著增强;在血清杀菌试验中，△htrA缺失株的存活率为2.8％，而亲本株的存活率为75.5％，△htrA缺失株相比亲本株抗血清杀菌能力显著降低;在生物被膜形成试验中，△htrA缺失株相比亲本株生物被膜形成量显著增加;小鼠毒力试验中，在相同攻毒剂量（1.4×109CFU/只）条件下，亲本株感染小鼠全部死亡，而缺失株感染小鼠仅死亡50％，△htrA缺失株相比亲本株毒力减弱。以上研究结果表明，HpHtrA蛋白对于副猪嗜血杆菌完整毒力的发挥必不可少，是该菌的重要毒力因子。
4、副猪嗜血杆菌HpHtrA蛋白酶切与分子伴侣功能研究
为了深入研究HpHtrA的功能，本试验首先表达了具有活性的rHpHtrA及其突变体蛋白，然后进行了一系列的分子伴侣试验和蛋白酶切试验。生物信息学分析显示，HpHtrA由一个N端信号肽序列、一个蛋白酶区和2个PDZ区组成。纯化的rHpHtrA及天然状态下的HpHtrA均表现出两种分子量形式。rHpHtrA同时具有分子伴侣活性和蛋白酶切活性，其突变体蛋白rHpHtrAH113R和rHpHtrAD143V的分子伴侣活性和蛋白酶切活性均显著降低，rHpHtrAS219A的分子伴侣活性和蛋白酶切活性无显著变化，表明His113和Asp143是HpHtrA的活性位点，而Ser219不是。HpHtrA能够保护膜蛋白免于DTT的变性作用，对膜蛋白具有分子伴侣作用。对经HpHtrA处理前后的HPS膜蛋白进行差异分析结合质谱鉴定发现，NikE，DppA和OmpA蛋白是HpHtrA的酶切底物。HpHtrA的蛋白酶切活性具有温度依赖性，功能发挥的最佳温度为40℃，且具有自降解作用。此外，通过双向电泳对亲本株和△htrA缺失株的分泌蛋白进行差异分析发现，HpHtrA不参与胞外蛋白的分泌。本研究更清晰地认识了HpHtrA的蛋白酶切与分子伴侣功能，为以HpHtrA为潜在药物靶点的研究提供了理论基础。