棉花(?)Jossypium hirsutum)是世界上最重要的经济作物之一,在我国国民经济中占据重要的地位。棉纤维是棉花生产的主要产品,其产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益,分离和鉴定与棉纤维产量和品质相关的基因并探究这些基因调控棉花纤维发育的分子机制,对棉花纤维品质的改良具有重要的理论和实践意义。近年来,已经分离克隆了大量棉纤维发育相关的基因,并对其中一些基因的功能进行了较为深入的研究,但是,有关棉纤维分子发育中棉花膜联蛋白基因的表达调控与功能研究较少。膜联蛋白(annexin)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,广泛存在于动植物的各种组织细胞中,植物膜联蛋白在植物生长发育和环境应答过程中都起着重要作用。为研究棉花膜联蛋白在棉花纤维发育过程中的作用,我们从棉纤维cDNA文库中分离克隆了4个新的膜联蛋白基因(cDNA),对这些基因的表达调控、启动子活性及其编码蛋白的亚细胞定位和Ca2+结合活性、以及基因功能等方面进行了研究。取得如下研究结果：1、棉花AnnGh基因的分离鉴定及其编码蛋白的结构分析从棉纤维cDNA文库中分离了4个新的膜联蛋白基因的cDNA,依次命名为AnnGh3、 AnnGh4、AnnGh5、AnnGh6。与已知的棉花膜联蛋白序列相比较,这4个基因无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平上均具有较高的同源性,相似度达56～95%。这些基因的编码蛋白都含有4个典型的膜联蛋白重复结构域(Ⅰ～Ⅳ),在第Ⅰ重复和第Ⅳ重复结构域中均含有典型的Ⅱ型Ca2+结合位点(G-X-G-T-{38}-E/D)；此外,在第Ⅰ重复结构域中还含有一个潜在的磷脂和血红素结合位点,在第Ⅲ重复结构中有F-actin结合基序(IRI),在第Ⅳ重复结构域中还含有GTP结合位点(DXXG)。以上分析结果表明,我们分离克隆的4个新基因属于典型的棉花膜联蛋白家族基因。2、AnnGh蛋白的亚细胞定位分析利用GFP荧光蛋白共定位技术研究了AnnGh蛋白的细胞亚定位。构建了AnnGh3和AnnGh6基因与eGFP的融合表达载体并转化棉花,获得稳定表达AnnGh:GFP荧光蛋白的愈伤组织。激光共聚焦显微镜观察结果显示这两个蛋白均定位于细胞质中。3、AnnGh蛋白钙离子结合活性分析构建了pMal-AnnGh3原核表达载体并成功表达出MBP-AnnGh3融合蛋白。荧光猝灭实验结果显示AnnGh3蛋白能与Ca2+结合,具有钙离子结合活性。4、AnnGhs基因在棉纤维中的表达调控实时定量RT-PCR分析表明,我们所分离鉴定的4个AnnGh基因在棉花中的表达具有组织差异性。AnnGh3、AnnGh4、AnnGh5三个基因均在纤维中优势表达,而AnnGh6主要在根中表达。AnnGh3/4/5在纤维中的表达受纤维发育阶段调控,其转录产物主要集中在伸长期的棉纤维中(3-12DPA),在15～20DPA的纤维中其表达活性显著下降。此外,这3个基因在纤维中的表达还受植物激素及体外钙离子的浓度调控。在棉纤维发育早期(0～2DPA),原位杂交实验结果亦显示AnnGh3和AnnGh5基因在纤维细胞和胚珠表皮细胞上有强烈的杂交信号,表明这两个基因可能参与了纤维细胞的起始分化。5、AnnGh3启动子活性分析分离得到了一个793bp的AnnGh3启动子片段,构建了AnnGh3p::GUS融合表达载体转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。GUS染色分析显示该启动子在3-10天幼苗的子叶、下胚轴和根部有较强的表达活性,随着植株的生长,其活性逐渐减弱。在成熟植株中,该启动子主要在萼片、花丝、果柄基部有较强的表达,花药中也有较弱的表达活性。此外,IAA、黑暗及H202处理均能增强其表达活性。有关该启动子在棉花组织细胞中,特别是纤维中的活性,尚有待分析验证。6、过量表达AnnGh3促进转基因拟南芥表皮毛分化发育将AnnGh3基因转化拟南芥,获得转基因植株。表型分析表明,AnnGh3基因过量表达促使转基因拟南芥莲座叶上表皮毛的密度和长度显著增加。与野生型相比较,转基因植株叶片表皮毛的密度增加了8.3～32.8%,平均长度增加了18～32μn,增长了5.8～10.4%,该结果表明AnnGh3能促进表皮毛的起始分化和伸长发育。鉴于拟南芥叶表皮毛与棉纤维细胞(种子表皮毛)的同源性,上述结果间接证明了AnnGh3基因可能在棉纤维的起始和伸长过程中发挥重要作用。7、植物树脂半薄切片染色方法的改进以棉花的幼根、幼茎、叶、胚珠和玉米幼茎为实验材料,将蕃红-固绿染色、苏木精-伊红染色、氯化铁-苏木精染色方法应用于植物树脂半薄切片研制中,对植物半薄切片染色方法等进行了改进,获得了结构完整、染色清晰半薄切片,建立了一套适合于植物树脂半薄切片制作的染色方法,为相关的实验研究提供了一种较为理想的显微制片技术。