衰老是细胞和有机体功能逐渐退化的过程,使个体容易受到外部环境或内部刺激的影响,继而导致疾病和死亡的风险增加。肾脏衰老（Renal aging）是遗传学,环境变化和细胞功能障碍相互作用的复杂过程,可导致其特征性的结构和功能改变,迄今为止,其发病机制尚未完全阐明。尽管衰老本身并不会引起肾脏损伤,但是正常肾脏衰老过程引起的生理改变会损害其修复能力,从而使老年人更容易罹患急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）、慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）和其他肾脏疾病。此外,肾脏衰老会影响老年患者在治疗疾病时药物的选择,同时也是肾移植供体和受体选择及预后的影响因素之一。年龄相关的肾功能下降与年龄相关的肾小球硬化密切相关。据报道,人们在30岁以后,每年约6000-6500个肾单位由于年龄相关性肾小球硬化而丢失。然而,在健康衰老过程中肾小球为什么会硬化,目前尚不清楚。有研究发现终末期分化的足细胞在其中起着关键作用。足细胞是增殖能力有限的神经元样上皮细胞。已有证据表明衰老相关的肾小球硬化是一种“足细胞病”。随着全球人口老龄化的加剧,肾脏衰老以及与年龄相关的肾脏损害将给全球社会、经济及医疗带来沉重的负担,已不可避免地成为肾脏病学实践的最大挑战。因此,寻找新的延缓肾脏衰老的治疗靶点具有十分重大的意义。糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase-3s,GSK3）是20世纪80年代被发现的一种在哺乳动物真核细胞中广泛表达、高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,因参与调控糖原的合成代谢而得名。越来越多的研究发现,GSK3是重要的细胞及多种信号通路的调节器,调节细胞的存活、增殖、分化及凋亡,并调节多种信号通路,进而参与胚胎发生、组织损伤、修复与再生、炎症及免疫调节等过程。GSK3分为α和β两种亚型,二者主要的分子结构非常相似,但它们有不同的分子“尾巴”,即N-和C-末端略有不同,导致他们的生物学作用完全不同。GSK3在衰老、阿尔茨海默氏症和2型糖尿病中扮演着Dr.Jeckel and Mr.Hyde的双面角色。在衰老中,GSK3α是长寿调节器,而GSK3β是一种促进衰老的调节因子。最近越来越多的证据表明,GSK3β涉及参与一系列疾病的发生发展,包括2型糖尿病、阿尔茨海默氏症、癌症、炎症性疾病、线粒体疾病、精神分裂症和双相情感障碍等。小剂量的锂,一种GSK3β抑制剂,已经被证明可以延长人类、线虫和果蝇的寿命。研究发现小剂量锂通过抑制GSK3β继而增强Nrf2活性来延长果蝇寿命,提示GSK3β可能是调节衰老的潜在药物靶点。前期研究提示,靶向抑制GSK3β可以减轻糖尿病肾病、阿霉素肾病及肾毒血清性肾炎等实验性小鼠的蛋白尿、足细胞损伤和肾小球硬化。然而,GSK3β在肾脏衰老过程中的表达及活性变化尚不清楚,其是否参与肾脏衰老的发生发展也不得而知。因此,我们分别在不同年龄段患者正常肾组织、足细胞特异性GSK3β基因敲除和Li Cl系统性治疗动物模型、以及体外足细胞培养中,研究GSK3β表达的变化及其对肾脏衰老的作用,并进一步探讨GSK3β参与肾脏衰老的潜在机制。第一部分人正常肾组织中,GSK3β过表达与肾脏衰老之间的关系目的在不同年龄段肾脏切除患者的正常肾组织中,观察肾脏的病理学特点、检测GSK3β及衰老标志物p16INK4A的表达情况,分析GSK3β与肾脏衰老标志物及特征性病理改变之间的关系,明确GSK3β在人类肾脏衰老中的作用。方法1.收集肾脏肿瘤拟行肾脏切除患者的临床资料,选择符合入组标准不同年龄段的患者入组。收集入组患者肾切除术后肿瘤边缘的正常肾组织,按照年龄阶段<30岁、30-59岁、60-79岁,将其分为青年组、中年组和老年组,每组各6例患者。2.采用PAS、Masson染色及电镜观察三组患者正常肾组织的病理特点。3.根据PAS、Masson染色及电镜结果定量分析三组患者硬化肾小球比例、间质纤维化评分及足细胞足突宽度。4.应用免疫荧光方法检测三组患者肾组织冰冻切片WT-1和Podocin的共定位。根据免疫荧光染色结果定量计数三组患者平均每个肾小球WT-1阳性细胞数。5.根据收集的临床化验数据,分析三组患者估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,e GFR）有无差异;应用线性回归分析平均每个肾小球中WT-1阳性细胞数目与e GFR的相关性。6.基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）方法预测GSK3β与人类肾脏衰老的关系。7.免疫组化染色检测三组患者肾组织连续石蜡切片GSK3β与p16INK4A的表达情况,并应用线性回归分析GSK3β和p16INK4A的相关性。8.线性回归分析肾小球GSK3β表达水平与肾小球硬化、WT-1以及e GFR的相关性。结果1.硬化肾小球的数量及比例在青年组、中年组和老年组中逐渐增多（P<0.01）。2.肾间质纤维化的程度在青年组、中年组和老年组中逐渐加重（P<0.01）。3.足突的宽度、细胞质吸收液滴在青年组、中年组和老年组中逐渐增多（P<0.001）,而平均每个肾小球中WT-1阳性的足细胞数目随着年龄增长逐渐减少（P<0.001）。4.e GFR在青年组、中年组和老年组中逐渐下降（P<0.001）。5.应用线性回归散点图分析三组患者平均每个肾小球中WT-1阳性细胞数目与e GFR的相关性,两者具有显著的正相关（R=0.65,P<0.01）。6.应用基因富集分析结果显示GSK3β基因表达高的区域,肾脏衰老基因也富集（P<0.001）。7.使用Image-Pro Plus图像分析软件计算平均每个肾小球中GSK3β和p16INK4A免疫组化染色分数,用平均光密度即累积光密度（IOD）/有效目标分布区域的面积（area）的比值来表示,代表了GSK3β和p16INK4A分子的相对表达水平。应用线性回归散点图分析GSK3β和p16INK4A在青年组、中年组和老年组中表达水平的相关性,结果显示两者具有显著的正相关（R=0.87,P<0.0001）。8.线性回归分析平均每个肾小球GSK3β表达水平在三组中与肾小球硬化比例具有显著的正相关（R=0.89,P<0.0001）,与WT-1的表达水平（R=-0.67,P<0.0001）及e GFR具有显著的负相关（R=-0.72,P<0.001）。结论1.肾脏衰老的特征性改变如肾小球硬化、肾间质纤维化、足细胞损伤及e GFR下降等随着年龄的增长逐渐加重。2.随着年龄增长,GSK3β在肾小球中的表达逐渐增多,并与衰老标志物p16INK4A及肾小球硬化比例具有显著的正相关,与平均每个肾小球WT-1计数及e GFR具有显著的负相关,提示GSK3β可能与人类肾脏衰老的发生发展密切相关。第二部分C57BL/6小鼠中,靶向抑制GSK3β对肾脏衰老的影响目的1.在2月龄、12月龄、24月龄的C57BL/6小鼠中,观察肾组织病理学改变,并分析GSK3β与肾脏衰老的相关性。2.明确足细胞特异性GSK3β基因敲除以及氯化锂（Li Cl）系统性给药后,是否会对肾脏衰老起保护作用。方法1.将C57BL/6小鼠按年龄分为2月龄组、12月龄组、24月龄组,收集三组小鼠的血、尿及肾组织标本,检测血肌酐（Serum creatinine,Scr）、尿蛋白/肌酐（Albumin/Creatinine rate,ACR）水平,取各组小鼠的随机尿行凝胶电泳及考马斯亮蓝染色;PAS染色观察肾小球硬化情况;电镜观察足细胞损伤情况;衰老相关性β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色观察肾小球衰老的情况。2.应用免疫荧光方法检测WT-1和Podocin的共定位及Fibronectin的表达,Western blot检测Podocin及Fibronectin的蛋白表达水平;免疫组织化学染色检测三组小鼠肾组织GSK3β及p16INK4A的表达情况,应用线性回归进行GSK3β与p16INK4A、肾小球硬化以及血肌酐水平的相关性分析。3.Western blot检测GSK3β、Ser9位点磷酸化GSK3β(p-GSK3βS9)、p16INK4A、p53、p21及p-Rb的蛋白表达水平。4.利用Cre/lox P技术构建条件性GSK3β基因敲除小鼠,免疫组化染色验证足细胞中GSK3β敲除是否成功。5.将小鼠随机分为12月龄野生型小鼠组（Control,Con）及GSK3β基因敲除小鼠组（Knockout,KO）、24月龄野生型小鼠组（Con）及GSK3β基因敲除小鼠组（KO）。检测各组小鼠血肌酐及尿白蛋白/肌酐（ACR）的值,并行尿凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。PAS染色观察各组小鼠肾小球硬化程度,电镜观察足细胞损伤情况,SA-β-gal染色观察肾小球衰老的情况。6.免疫荧光检测WT-1、Podocin及Fibronectin。免疫组化检测各组小鼠肾小球p16INK4A的表达情况。7.Western blot检测p16INK4A、p53、p21、Podocin、Fibronectin及p-Rb的蛋白表达水平。8.将12月龄正常的C57BL/6小鼠随机分为两组,氯化锂（Li Cl）治疗组和氯化钠（Na Cl）对照组。分别给与两组小鼠每周一次皮下注射Li Cl或Na Cl,持续3或6个月,即小鼠的终点时间为15月龄和18月龄。9.取各组小鼠相应时间点的随机尿液进行凝胶电泳考马斯亮蓝染色;检测各组小鼠尿ACR及血肌酐的值。免疫荧光检测WT-1,SA-β-gal染色观察各组小鼠肾小球衰老的情况。10.Western blot检测p16INK4A、p53、p21、及p-Rb的蛋白表达水平。结果1.尿蛋白/肌酐（ACR）及血肌酐水平在2月龄组、12月龄组及24月龄C57BL/6小鼠中逐渐升高（P<0.001）。2.硬化肾小球的数量及比例在三组中逐渐增多（P<0.001）,足突的宽度在三组中逐渐增多（P<0.01）,SA-β-gal阳性的细胞数目在三组小鼠肾小球中逐渐增多（P<0.0001）。3.WT-1及Podocin在三组小鼠肾小球中的表达逐渐减少,而Fibronectin逐渐增多（P<0.001）。4.GSK3β及p16INK4A在三组小鼠肾小球中的表达逐渐增多且存在显著的正相关性（R=0.88,P<0.0001）,GSK3β的表达与肾小球硬化（R=0.84,P<0.0001）、血肌酐水平（R=0.72,P<0.001）之间也存在显著的正相关。GSK3β、p53、p21及p16INK4A的蛋白水平在三组小鼠肾小球中逐渐升高（P<0.0001）,p-GSK3βS9及p-Rb的蛋白水平在三组小鼠肾小球中逐渐减少（P<0.0001）。5.12-KO组小鼠的尿ACR及血肌酐水平明显低于12-Con组,差异有统计学意义（P<0.05）;24-KO组小鼠的尿ACR水平及血肌酐也明显低于24-Con组,差异有统计学意义（P<0.05）。6.12-KO组小鼠的足细胞宽度明显低于12-Con组（P<0.05）;24-KO组小鼠的足细胞宽度也明显低于24-Con组（P<0.05）。7.12-KO组小鼠肾小球的Fibronectin、p16INK4A、p53及p21的蛋白水平及SA-β-gal阳性的细胞数目明显低于12-Con组,而Podocin及p-Rb的蛋白水平高于12-Con组（P<0.05）;24-KO组小鼠肾小球的Fibronectin、p16INK4A、p53、及p21的蛋白水平及SA-β-gal阳性的细胞数目明显低于24-Con组,而Podocin及p-Rb的蛋白水平高于24-Con组（P<0.05）。8.12-KO组小鼠肾小球的WT-1及Podocin的表达明显高于12-Con组（P<0.05）;24-KO组小鼠肾小球的WT-1及Podocin的表达明显高于24-Con组（P<0.05）。9.15月龄Li Cl组小鼠WT-1的表达明显高于15月龄Na Cl组小鼠;18月龄Li Cl组小鼠WT-1的表达也明显高于18月龄Na Cl组小鼠（P<0.05）。10.15月龄Li Cl组小鼠尿ACR及血肌酐值、肾小球SA-β-gal阳性细胞数及p16INK4A、p53、p21的蛋白水平明显低于15月龄Na Cl组小鼠,而p-Rb的蛋白水平高于15月龄Na Cl组小鼠;18月龄Li Cl组小鼠尿ACR及血肌酐值、肾小球SA-β-gal阳性细胞数及p16INK4A、p53、p21的蛋白水平也明显低于18月龄Na Cl组小鼠,而p-Rb的蛋白水平高于18月龄Na Cl组小鼠。结论1.随着年龄增长,C57BL/6小鼠肾小球衰老逐渐加重,GSK3β在肾小球中的表达逐渐增多,活性增强,并与衰老标志物p16INK4A、肾小球硬化及血清肌酐水平具有显著的正相关,提示GSK3β与小鼠肾脏衰老的发生发展密切相关。2.足细胞特异性GSK3β基因敲除可以延缓C57BL/6小鼠的肾小球衰老。3.通过Li Cl抑制GSK3β活性,可以延缓C57BL/6小鼠的肾小球衰老。第三部分体外实验中,靶向激活或抑制GSK3β对足细胞衰老及细胞衰老信号通路的影响目的1.通过足细胞原代培养、Li Cl处理永生化小鼠足细胞以及转染GSK3β过表达S9A或者GSK3β失活质粒KD等方法观察足细胞衰老的变化,明确GSK3β对足细胞衰老的作用。2.在分离的肾小球和培养的永生化小鼠足细胞中检测GSK3β与细胞衰老信号转导分子p16INK4A或p53之间的关系,明确GSK3β是否参与细胞衰老信号通路的调控。方法1.提取来自12月龄野生型及12月龄足细胞特异性GSK3β基因敲除型小鼠的原代足细胞进行培养,再分别转染入空载体（EV）和WT-GSK3β质粒,将细胞分为Con+EV组、KO+EV组及KO+WT组。2.免疫荧光检测各组细胞Synaptopodin、F-actin及γH2AX的表达情况。SA-β-gal染色观察各组足细胞的衰老情况。通过Western blot检测三组HA、Synaptopodin、γH2AX、GSK3β、p16INK4A、p53、p21及p-Rb的蛋白表达水平。3.应用免疫共沉淀在分离的肾小球和培养的永生化小鼠足细胞中检测GSK3β与细胞衰老信号转导分子p16INK4A和p53蛋白的相互作用关系。4.在小鼠肾组织切片和培养的永生化足细胞中,免疫荧光检测GSK3β和p16INK4A或者p53的共定位情况。5.利用蛋白磷酸化位点预测工具GPS 5.0分析GSK3β磷酸化p16INK4A和p53蛋白的位点。6.Li Cl处理永生化小鼠足细胞、或者分别转染入空载体（EV）、GSK3βS9位点持续激活（S9A）质粒,GSK3β失活（KD）质粒、将细胞分为EV组、S9A组、KD组和EV+Li Cl组。7.免疫荧光检测各组细胞Synaptopodin、γH2AX及F-actin的表达情况,SA-β-gal染色观察各组足细胞的衰老情况。8.Western blot检测各组Synaptopodin、HA、γH2AX、GSK3β、p16INK4A、p53、p21及p-Rb的蛋白表达水平。9.免疫沉淀检测各组培养足细胞中p16INK4A和p53蛋白Ser位点磷酸化的表达量。结果1.KO+EV组Synaptopodin、p-Rb的蛋白表达水平及细胞骨架的完整性均高于Con+EV组和KO+WT组（P<0.05）;KO+EV组γH2AX、GSK3β、p16INK4A、p53、p21的蛋白表达水平均低于Con+EV组和KO+WT组（P<0.05）。2.KO+EV组平均每显微镜视野γH2AX或者SA-β-gal阳性细胞计数小于Con+EV组（P<0.05）和KO+WT组（P<0.05）。3.肾小球匀浆和足细胞裂解物分别行免疫共沉淀检测,结果显示p16INK4A或p53与GSK3β始终共沉淀。4.免疫荧光检测显示GSK3β和p16INK4A或p53具有共定位的区域,主要存在足细胞的细胞浆中。5.蛋白磷酸化位点预测工具GPS5.0预测结果显示GSK3β可以在多个位点磷酸化p16INK4A和p53蛋白。6.S9A组Synaptopodin、p-Rb蛋白水平及细胞骨架的完整性均低于其余各组（P<0.05）;S9A组γH2AX、GSK3β、p16INK4A、p53、p21的蛋白表达水平及SA-β-gal阳性细胞数均高于其余各组（P<0.05）;KD组及EV+Li Cl组Synaptopodin、p-Rb蛋白水平及细胞骨架的完整性均高于EV组;KD组及EV+Li Cl组γH2AX、GSK3β、p16INK4A、p53、p21的蛋白表达水平及平均每显微镜视野γH2AX或者SA-β-gal阳性细胞数均低于EV组（P<0.05）。7.免疫沉淀结果显示S9A组p-Ser-p16INK4A和p-Ser-p53均高于其余各组;KD组及EV+Li Cl组p-Ser-p16INK4A和p-Ser-p53均低于其余两组。结论1.足细胞特异性GSK3β基因敲除对足细胞衰老具有保护作用,且有可能是通过抑制p16INK4A/p-Rb和p53/p21细胞衰老信号通路。2.GSK3β持续活化会激活p16INK4A/p-Rb和p53/p21信号通路,促进足细胞衰老。3.GSK3β失活会抑制p16INK4A/p-Rb和p53/p21信号通路,减轻足细胞衰老。4.Li Cl通过抑制GSK3β,进而抑制p16INK4A/p-Rb和p53/p21信号通路,减轻足细胞衰老、保护细胞骨架的完整性。