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目的构建结核杆菌ESAT-6基因穿梭质粒,在耻垢分枝杆菌中表达蛋白并对重组蛋白进行鉴定,同时利用电转化方法,将重组质粒转化到卡介苗中,为疫苗研究奠定实验基础;构建能在毕赤酵母表达系统中表达结核杆菌ESAT-6蛋白的重组质粒,并对其表达产物进行基本生物学特性鉴定,为新型结核病疫苗的研究开发提供研究依据。方法[1]从GenBank获得结核分枝杆菌ESAT-6基因DNA序列,根据该序列及ps3000表达载体的要求,设计和合成一对引物,利用PCR技术扩增ESAT-6基因,并插入pGEMT载体,进行PCR,双酶切及测序鉴定。[2]亚克隆法构建ps3000—ESAT-6大肠杆菌--分枝杆菌穿梭质粒,经电转化法导入到耻垢分枝杆菌和卡介苗中,Western blot鉴定其生物学活性。[3]设计和合成毕赤酵母表达引物并引入酶切位点,扩增ESAT-6基因,并插入pGEMT载体,进行PCR,双酶切及测序鉴定。[4]亚克隆法构建pPICZaA-- ESAT-6穿梭质粒,经化学转化法整合毕赤酵母GS115染色体中,PCR鉴定目的基因的整合,Zeocin抗性筛选多拷贝重组子并诱导表达,表达产物用Western-blot鉴定其表达。结果[1]成功扩增了结核分枝杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。[2]从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因片段,成功构建重组表达质粒pPICZaA-ESAT-6,SDS-PAGE显示胞外并无表达,酵母细胞经裂解后ESAT-6基因翻译的蛋白加上载体的信号肽序列和c-myc表位一共18kDa左右在蛋白胶上相应位置有表达,并且能被结核病人血清抗体所识别。结论[1] ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG( Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。[2]利用毕赤酵母表达系统获得胞内表达的结核杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。