microRNAs（miRNAs）是一类大小为18-23 nt的小的非编码RNA分子,它们是由具有发夹结构的、70-90个碱基大小的单链miRNA前体（pre-miRNA）经Dicer加工产生。miRNA在生物界中是广泛存在的,自从第一个miRNA分子在线虫中发现,迄今为止,已发现在人、动物、植物等多种生物中存在。目前,已有超过3,500个miRNA被鉴定,在人体中miRNA的种类也超过了450种。研究发现,miRNA序列不是任意的,在很大的进化距离中具有保守性,提示这种分子在生命活动中可能扮演重要的角色。miRNA在胞浆中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC（miRNA induce silencing complex）;在miRNA的指引下,miRISC可以特异性的识别mRNA分子的3’端约30碱基长度的非编码区,并以一种不完全匹配的方式结合,抑制mRNA翻译蛋白分子。正是由于这种不完全匹配的结合方式,使得一种miRNA可以同多种mRNA分子结合。人们通过生物信息学手段发现,人类有1/3以上的的蛋白编码基因中都受miRNA调节。miRNA通过调节目的蛋白的表达,在生物体发育、信号传导、凋亡、细胞增殖等生理和病理过程中都发挥重要作用。既然miRNA在生命活动中扮演如此重要的角色,它们是否也在病毒感染性疾病中的发生、发展过程中也有重要作用?miRNA本身的几个特性提示其可能在病毒感染过程中发挥作用。一方面,miRNA分子较小,没有免疫原性,可以逃避机体的免疫系统;miRNA较小,只有22 nt左右大小,对于充分利用基因组每个碱基的病毒来说通过编码小分子量的miRNA来调控基因是一种十分“经济”的选择;另外,一种miRNA可与多个mRNA结合,调节多种蛋白的表达,是一种十分有效的调控基因表达的手段。因此,病毒完全有可能借助于miRNA调控众多蛋白表达,使宿主细胞的内环境有利于病毒的生命活动。后续的大量研究结果也证实了上述猜想,很多病毒可以通过某些机制,改变宿主细胞内各种miRNA表达,使宿主细胞内环境有利病毒的生存。这种现象也提示我们可以通过研究宿主细胞感染病毒前后各种miRNA表达变化,并在此基础之上,研究表达发生改变的miRNA的作用的靶标分子,探索这些miRNA在病毒生命周期中的作用,将有利于我们深入了解病毒感染性疾病的发病机制,并能为这类疾病的诊断、预防及治疗等提供有益的帮助。乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）,是一种小的双链DNA病毒,是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒,属于属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。HBV感染肝细胞后,能引起一系列的疾病,如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,还往往伴有严重的并发症。据推测,世界范围内有3.5亿人为乙肝慢性感染,是威胁人类健康的主要的感染性疾病之一。尽管迄今为止,关于HBV感染的研究取得一定的进展,对于这种疾病的发生、发展、转归及防治有了一定程度上的认识。但在这些领域还有很多未知的空白有待填补。寻找HBV感染后肝脏细胞内表达水平发生改变的miRNA,然后在此基础之上研究这些特定miRNA功能,看其是否在HBV感染过程中发挥作用,或许有利于进一步揭示HBV感染、特别是慢性HBV感染的致病机制。正是基于此,在本研究中,我们利用miRNA芯片技术,分析HBV感染前后miRNA变化情况,寻找显著上调或下调的miRNA;然后分析这些miRNA的功能,看其是否在HBV感染中发挥作用;以期为HBV感染机制的阐明,以及乙型肝炎的预防和治疗提供帮助。首先,我们利用Exiqon公司的miRNA microarray芯片（8.0）,以HepG2.2.15为实验组,以HepG2细胞为对照,分析二者miRNA表达谱系的差异,找出表达水平显著改变（上调或下调超过2倍）的miRNA。HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞株HepG2细胞转染HBV基因后的细胞,HBV基因已稳定整合,能分泌各种病毒蛋白和病毒颗粒,是研究HBV感染的一个理想的体外模型。Exiqon公司的miRNA microarray芯片能检测到miRBase数据库（8.0版）中所有已注册的人的miRNA分子;而且该芯片基于锁核酸（Locked Nucleic Acids,LNA）技术构建,使芯片杂交时具有较高而一致的杂交温度,可以较灵敏、特异性地检测差异表达的miRNA。利用该芯片对HepG2.2.15和HepG2细胞的miRNA表达谱进行分析后,发现有9个miRNA的表达发生显著变化。其中上调的有3个,分别为hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345;下调的miRNA共有6个,分别为:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b。为了进一步验证上述芯片结果的可靠性,我们采用Taqman miR-qRT-PCR试剂盒（Applied Biosystems,Foster City,America）对HepG2和HepG2.2.15细胞中上述9种miRNA分子表达情况进行分析。U6是一种在各种细胞中表达较为稳定的RNA,在本实验中作为内对照使用。所得数据采用2^-△△CT方法进行分析。最终分析结果与芯片结果相符,即显著下调的为hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b;而显著上调的miRNA为hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345,说明芯片结果是可靠的。然后,我们进一步验证上述miRNA表达发生改变,是HBV引起的一种特异性变化,还是一般病毒感染后引起的一种非特异性变化。我们首先建立了4种非HBV感染的HepG2细胞,并进行了鉴定。这4种病毒分别为猫免疫缺陷病毒（felineimmunodeficiency virus,FIV）、鼠干细胞病毒（Murine Stem Cell Virus,MSCV）、登革病毒（Dengue virus,DV）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）,其中前3种为RNA病毒,后一种为DNA病毒。然后,利用Taqman RT-PCR试剂盒检测这些病毒感染细胞株（即HepG2-FIV、HepG2-MSCV、HepG2-DV、HepG2-HSV）中hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-23b、hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345的表达情况。结果表明在这些非HBV感染的HepG2细胞中,上述miRNA的表达未发生显著性改变,提示,HepG2.2.15细胞中上述miRNA表达发生显著改变是HBV特异性的。由于HepG2.2.15是通过将含有HBV全基因组的质粒转染HepG2细胞建立的稳定克隆,是模拟HBV感染,与真正的HBV感染细胞有一定的差异。而PLC/PRF/5是从—HBV感染者体内分离得到,是自然整合有HBV的一株肝癌细胞株,是研究HBV感染的另外常用的体外模型。因此,我们进一步检测了上述miRNA在该细胞中的表达情况。实验结果表明:hsa-miR-194和hsa-miR-200a显著性上调;hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f下调表达,而hsa-miR-24、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-23b和hsa-miR-345的表达水平则没有发生显著性变化。提示hsa-miR-194、hsa-miR-200a、hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f表达发生改变可能与HBV感染相关。但无论分析miRNA在HepG2.2.15细胞的表达情况、在非HBV感染细胞株中的表达情况,还是在PLC/PRF/5细胞的表达情况,只是为我们提供了一种离体状态下的情况。真正的体内过程往往与体外过程有不小的差异,因此我们进一步检测了miRNA在慢性乙肝患者肝脏标本中的表达情况,揭示miRNA在体内的表达状态。利用定量PCR方法检测了12个慢性乙肝患者的穿刺标本miRNA表达情况,以3例肝移植手术中健康供体肝脏组织作为正常对照。结果表明:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-23b、hsa-miR-194表达水平没有发生显著性改变;hsa-miR-24、hsa-let-7c和hsa-mir-200a在某些标本中表达下调,而在另外一些标本中则表达上调;只有hsa-let-7a和hsa-let-7f在12例标本中均显著性下调。综上所述,hsa-let-7a和hsa-let-7f最可能是HBV感染后肝脏细胞内表达水平发生显著改变的miRNA。那么,是否HBV通过下调hsa-let-7a和hsa-let-7f,改变肝脏细胞内环境,使之更有利于HBV的感染过程?既往研究表明,miRNA可能通过以下几种机制参与病毒感染的致病过程:宿主的miRNA作用于病毒基因,调控病毒基因的表达;病毒基因组编码病毒来源的miRNA,调控病毒基因的表达;病毒基因组来源的miRNA作用宿主基因,调控宿主基因的表达。因此,HBV感染后肝细胞内变化的miRNA,即hsa-let-7a和hsa-let-7f是否也可以作用于HBV基因,并调控这些基因编码蛋白的表达?ViTa是由Hsu PW等建立的一个软件（http://vita.mbc.nctu.edu.tw/）,可以较好地预测人的miRNA在病毒基因中靶标。我们借助于该软件预测了hsa-let-7a和hsa-let-7f在HBV基因组中的靶标。预测结果表明:hsa-let-7a在HBV基因组中有一个潜在的靶标,3105-3135处位于Pres1和多聚酶（P蛋白）的共同编码区（3105-3135处）,该区域在乙肝的生命周期中具有重要作用;没有发现HBV基因组中有hsa-let-7f的作用位点。为了验证该潜在位点是否为hsa-let-7a的作用位点,我们将该序列导入pMIR-REPORT荧光素酶表达载体,构建报告系统;同时,将let-7a表达质粒PH1-RNA-let-7a导入293T细胞,通过抗生素筛选后得到单克隆,qRT-PCR鉴定后,我们得到2株稳定表达let-7a的细胞株,293-7a-1和293-7a-2。将含有靶序列的pMIR-report导入293-7a-1和293-7a-2后,进行荧光素酶实验,结果提示,hsa-let-7a可以作用该位点,降低荧光素酶的表达。为进一步验证,我们将let-7a表达质粒导入HepG2.2.15细胞株,上调hsa-let-7a的表达,检测HBV拷贝数及上清中Pres1蛋白水平变化情况。实验结果表明,hsa-let-7a上调后,HBV DNA拷贝数显著降低,上清中pres1蛋白水平也明显下降,进一步证实了HBV基因组中hsa-let-7a作用位点的存在。综上所述,在本实验中,我们借助于microRNA芯片技术,以HepG2.2.15细胞作为HBV的体外感染模型以HepG2细胞作为对照,分析表达显著改变的miRNA;然后利用定量PCR对芯片结果进行验证后,进一步检测了这些miRNA在一系列的细胞株及慢性乙肝患者肝穿标本中的表达情况,结果提示HBV感染引起肝细胞内hsa-let-7a和hsa-let-7f显著下调。然后,我们进一步分析了hsa-let-7a和hsa-let-7f的靶标,利用ViTa软件预测二者在HBV基因组的潜在作用位点,并通过荧光素酶等实验进行了验证。结果发现hsa-let-7a能作用于HBV的多聚酶和PreS1蛋白的共同编码区。或许,HBV感染肝细胞后,通过某种机制下调hsa-let-7a的表达,使HBV的PreS1蛋白和多聚酶免受let-7a的抑制,从而使肝细胞内环境有利于HBV的生命活动,可能是HBV感染的致病机制之一。