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石斑鱼是我国南方沿海地区重要的海水养殖经济鱼类，它不仅肉质鲜美，而且营养丰富，广受人们的喜爱。但随着集约化高密度养殖以及养殖规模的不断扩大，导致各种疾病频繁爆发，给石斑鱼养殖产业造成巨大的经济损失，严重威胁到了石斑鱼养殖产业的健康可持续发展。因此，研究石斑鱼自身免疫相关基因及其机制，提高其免疫力和抗病力，对石斑鱼的健康养殖十分重要。溶菌酶是一种能水解肽聚糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的水解，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解;在机体先天免疫系统中参与多种免疫反应，并协同其他免疫因子共同防御外来病原的入侵。溶菌酶还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复合物使病毒失活。组织蛋白酶B是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，在产生和清除生物活性分子方面起重要作用，包括降解各种蛋白为机体提供营养，清除细胞中残缺、不正常的多肽，或激活其他蛋白水解酶系统，参与机体的多种生理和病理活动。为了更好地研究分析石斑鱼的免疫机制，本论文对斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）溶菌酶和组织蛋白酶B进行了克隆与功能分析，取得了如下创新性研究结果:
1、运用RACE技术，从石斑鱼脾组织中克隆获得两种类型的溶菌酶:C型(Ec-lysC)和GB型(Ec-lysGB)全长cDNA。其中，Ec-lysC的cDNA全长为533bp，编码144个氨基酸;全基因组包含4个外显子和3个内含子，其编码的氨基酸序列与已报道C型溶菌酶基因具有较高的同源性，均具有保守的催化位点和8个保守的半胱氨酸残基;Blast比对发现该基因序列与褐石斑鱼具有94％的同源性。Ec-lysGB的cDNA全长为1419bp，编码256个氨基酸;全基因组包含4个外显子和3个内含子，氨基酸比对发现具有保守的催化位点和底物结合位点;Blast比对发现该基因序列与半滑舌鳎具有62％的同源性。亚细胞定位结果显示Ec-lysC和Ec-lysGB在石斑鱼脾细胞(GS)中主要为细胞质分布。石斑鱼两种类型溶菌酶呈泛组织分布，在免疫组织头肾中都有较高的表达量。经LPS、溶藻弧菌和石斑鱼虹彩病毒SGIV刺激石斑鱼后，对其两种类型溶菌酶在头肾中的表达量进行荧光定量PCR分析，结果显示表达量均具有不同程度的升高，说明其在细菌和病毒的感染中发挥了相对重要的作用。通过构建原核表达载体，将重组蛋白C型溶菌酶(rEc-lysC)和GB型溶菌酶(rEc-lysGB)纯化后，检测其抗菌活性。结果表明，rEc-lysC最适作用pH值为5.5，最适作用温度为55℃;rEc-lysGB最适作用pH值为6.0，最适作用温度为35℃。体外抗菌活力结果表明，两种溶菌酶对溶壁微球菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌都有一定的抑制性，但作用效果有差异。扫描电镜结果显示，与对照组相比，rEc-lysC对溶壁微球菌的表面形态破坏作用强于rEc-lysGB。为进一步研究两种类型溶菌酶在SGIV感染中的作用，我们筛选了两种类型溶菌酶过表达的稳定细胞系，检测了C型和GB型溶菌酶过表达情况下SGIV的感染情况。结果揭示，两种类型溶菌酶过表达均能抑制SGIV感染的CPE进程，降低了病毒主要衣壳蛋白MCP的表达，但C型溶菌酶的抗病毒效果较明显。
2、通过RACE技术从石斑鱼脾组织中获得了石斑鱼组织蛋白酶B(命名为Ec-CB)的cDNA，其cDNA全长为1918bp，编码330个氨基酸，氨基酸比对发现与人类组织蛋白酶B相似，具有典型的结构特征，包括前肽区和半胱氨酸蛋白酶结构域，后者包含了四个高度保守的催化位点和三个活性位点，进化分析显示其与紫红笛鲷和条石鲷相似度最高。RT-PCR结果显示，石斑鱼组织蛋白酶B在各个组织中均有分布，且主要在脾脏、头肾、肾脏中表达量相对较高。荧光定量PCR结果表明，经SGIV刺激后，Ec-CB在头肾中的表达量在24h有明显上调。重组表达的Ec-CB(rEc-CB)表现出明显的蛋白酶活性，其最适作用pH值为4。进一步选用组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me处理SGIV感染的GS细胞和FHM细胞，我们发现抑制组织蛋白酶B的活性明显延缓了细胞病变，且抑制了病毒的复制，表明组织蛋白酶B可能参与了病毒感染宿主细胞的过程，但具体的作用机制还有待于进一步研究。
以上研究结果表明石斑鱼溶菌酶在宿主抵御细菌和病毒感染的免疫反应中发挥了重要的作用，组织蛋白酶B也可能参与了SGIV感染的免疫反应，这不仅丰富了石斑鱼先天性免疫的内容，也为进一步探索石斑鱼免疫机制及疾病防治提供新的策略和理论依据。