研究背景：人体肠道感染性腹泻大多是由细菌、病毒引起,但近年来由肠道寄生性原虫引起的腹泻逐渐增多。肠道寄生原虫属于原生动物亚界,广泛分布于自然界的各种生态环境中,不少原虫既可感染人类,又可寄生于某些动物,大多以水作为主要传播载体,是引起腹泻的主要病原体之一。隐孢子虫(Cryptosporidium)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)作为可感染包括人在内的大多数动物胃肠道的寄生性原虫,可引起宿主轻重不一的感染,具有明显的发病率和病死率。免疫功能正常的个体,感染了隐孢子虫和贾第虫(以下合称为两虫)可导致急性、自身限制性腹泻；但对于免疫力较弱者,尤其婴幼儿、免疫功能缺陷者则可引起严重腹泻,甚至死亡。隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)和贾第虫病(Giardiasis)的发生和传播主要通过粪-口传播,多种途径感染,包括人-人接触,动物-人接触,摄入被卵(包)囊污染的水、食物,与污染的环境物接触等。病原体特征有待深入研究目前国外对隐孢子虫和贾第虫的病原学特征、流行病学、基因组学等已进行了大量的研究,但国内对其流行病调查研究仍仅停留在简单粗糙的检出水平上,尚未见隐孢子虫病和贾第虫病分子流行病学和基因分型的系统报道,相关研究工作还有待进一步加强。病原体检测方法有新进展检测隐孢子虫和贾第虫的方法很多,包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测等。应用显微镜对粪便标本进行病原学检测多年来被认为是检测隐孢子虫和贾第虫的“黄金方法”,然而该方法极易漏检,仅适用于有腹泻症状且排出卵(包)囊量较大的患者,并且特异性低、费时、费力；而免疫学检测由于操作复杂且不能用于早期诊断,其应用也受到了一定限制。目前,分子生物学方法已广泛应用于隐孢子虫和贾第虫的检测,该方法相对其他传统方法除了具有高灵敏性、特异性强的优点外,还可以进行虫种、基因型及亚基因型的区分,并且能同时检测大量样本。研究表明巢式聚合酶链反应(Nested PCR)检测隐孢子虫和贾第虫的敏感性可以达到1个卵(包)囊,无论是检测环境样本还是临床样本,此方法相对于传统的方法在敏感性特异性上均有了较大的提高。既往虽然对隐孢子虫和贾第虫病例报道少,但实际病人或感染者众多,只是无症状的或症状轻的居多,其危害尚未引起足够的重视。再者以往传统实验室镜检方法检出率较低,报道的感染率并不能反映其实际感染情况,因此,基于灵敏性高特异性强的检出方法,连续长期地对隐孢子虫和贾第虫的感染情况进行监测,能为进一步研究提供丰富可靠的资料。流动人口两病的防控有待加强广州地区旅游业发达,人口密集且流动性大,城区和城乡结合部人员构成复杂,经济条件、知识水平、行为卫生习惯等参差不齐,而感染性疾病中的腹泻发病率一直居高不下。本研究分别采用病原学检测方法和Nested PCR法对广州市哨点医院2012年6月～2013年5月期间就诊的腹泻病人进行隐孢子虫病和贾第虫病的分子流行病学调查,希望能了解隐孢子虫和贾第虫在广州地区的感染和流行现况,估计广州地区是否存在暴发流行的潜在隐患,研究其分子流行病学和基因型分型特征,为我国隐孢子虫和贾第虫的流行病学调查提供全面系统的背景资料。研究目的：1.了解2012年6月～2013年5月广州市哨点医院门诊腹泻病人隐孢子虫和贾第虫感染状况及流行病学特征,完善我国原虫性腹泻的流行病学基础资料；2.了解该地区腹泻病人隐孢子虫和贾第虫的基因型及亚基因型别,探讨其流行优势株,明确分子特征及基因型分布情况；3.为广州地区儿童和成人原虫感染性腹泻的研究提供丰富的背景资料。研究方法：1.标本收集：收集2012年6月至2013年5月期间在广州市某三甲医院及城中村社区医院门诊就诊的348例年龄14岁及以下腹泻儿童和110例年龄18岁及以上的成人腹泻患者的粪便标本、人口学资料及流行病学资料。2.标本处理方法：每份粪便标本取5-10g或5～10ml,加入2.5%重铬酸钾溶液,震荡后制成10%的悬液,分装三管后4℃保存备用。3.标本中隐孢子虫和贾第虫检测方法：使用改良抗酸染色法和卢戈氏染色法对所有样本分别进行隐孢子虫和贾第虫显微镜检查；利用Nested PCR法,对所有样本以18SrRNA基因和磷酸丙糖转移酶(TPI)基因为目的基因分别进行隐孢子虫和贾第虫感染的检测；对PCR阳性产物进行测序,应用BLAST软件将测序结果在GenBank上寻找各阳性株的同源序列,使用MEGA5.0软件的邻接法(neighbour-joining method, NJ)构建系统进化树,分析隐孢子虫和贾第虫的基因型和亚基因型,判断其流行优势株。4.统计分析方法：采用Epidata2.1软件对调查数据进行双份录入,运用统计软件SPSS13.0对收集的资料进行统计学分析,分析广州地区隐孢子虫病和贾第虫病的流行病学特征,检验水准α为0.05。结果：1.2012年6月至2013年5月共收集广州市哨点医院14岁及以下腹泻儿童粪便标本和问卷共348份。腹泻儿童监护人文化程度以大专及以上为主,占69.9%(226/323),职业以办公室白领占最多,为27.7%(89/321)。2.调查了110名18岁及以上符合条件的成人腹泻患者,平均年龄(38.91±16.62)岁。患者文化程度以大专及上为主,为62.7%(69/110),职业分布以办公室白领占最多,为22.7%(25/110)。3.腹泻儿童隐孢子虫的阳性率为3.45%(12/348),发病高峰以3岁内婴幼儿为主。检出季节有两个高峰,为3月～4月和11月～12月。阳性患儿83%有饭前便后洗手但有67%平时有吸吮手指的习惯,生活饮用水种类以自来水为主。检出的12株隐孢子虫经测序分型,8株为C.hominis,4株为C.parvum,其中Ia亚型6株,Ib亚型2株,Ⅱa亚型3株,Ⅱd亚型1株。4.腹泻成人隐孢子虫的阳性率为1.8%(2/110),两例均为中老年人,未能发现明显季节分布特点。2个分离株均为C.hominis和Ⅰa基因亚型,未发现其他基因型别。5.腹泻儿童贾第虫的阳性率为4.60%(16/348),主要感染3岁以内婴幼儿,以2-3岁年龄段检出率最高,检出高峰为7月至10月。75%儿童平时有饭前便后洗手,但有69%平时有吸吮手指的习惯,生活饮用水种类以自来水为主。16株贾第虫经测序分型,14个分离株为集聚型A,2个分离株为集聚型B；集聚体A中9个为A-Ⅰ亚型,5个为A-Ⅱ亚型,而2个集聚体B均为B-Ⅲ亚型。6.腹泻成人贾第虫的阳性率为3.6%(4/110),年龄分布除了18～30岁间,其余年龄段均有检出,检出季节集中在8-10月夏秋季节,其他月份未有检出。4份阳性产物经测序,均为集聚型A,未发现其他基因型。集聚体A中3个为A-Ⅰ亚型,1个为A-Ⅱ亚型。7.两种诊断方法检测腹泻患者的隐孢子虫和贾第虫感染的检出率有不同,PCR法比染色法的检出率高。结论：1.原虫性腹泻也是引起儿童和成人腹泻的重要病原体,就算是经济发达的广州地区,儿童和成人均存在隐孢子虫和贾第虫的感染,人群分布主要感染3岁以内的儿童为主。隐孢子虫的检出高峰于春季和冬季,贾第虫在夏秋季节检出最高。2.引起广州市哨点医院腹泻儿童和成人隐孢子虫病的10株为C.hominis,4株为C.parvum,流行株可能为C.hominis及其Ia基因亚型。贾第虫18个分离株为集聚型A,2个分离株为集聚型B,可能主要流行集聚型A。两虫导致腹泻的基因型别多样,应引起重视。3.两种诊断方法检测腹泻患者的隐孢子虫和贾第虫感染的检出率有不同,PCR法比镜检染色法的检出率高,且能分析其种属和基因型别。运用分子生物学方法能更准确地揭示两虫的实际感染情况。