论文部分内容阅读
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序死亡。当细胞内某些控制凋亡的基因突变,导致细胞不能凋亡过度增殖形成癌。使用天然化合物诱导突变的凋亡基因使癌细胞凋亡是目前最有效的抗癌手段。为了从具有抗癌作用的黄花石蒜和臭马比木中寻找具有诱导癌细胞凋亡的成分,本文通过甲醇提取、分离黄花石蒜和臭马比木化学成分及分析黄花石蒜提取物(DELA)成分,建立臭马比木有效成分的HPLC检测方法、优化制备工艺,采用Annexin V-FITC/PI法、MTT法筛选诱导癌细胞凋亡成分,使用荧光定量PCR、Western bloting分析诱导癌细胞凋亡机制,取得以下研究成果：(1)采用甲醇提取法从黄花石蒜中提取分离得到高石蒜碱、力可拉敏、加兰他敏及DELA,从臭马比木中得到9-甲氧基喜树碱、喜树碱、5-羟基喜树碱(非对映异构体),LC-MS分析发现DELA中含有高石蒜碱、2a-hydroxyoduline、oduline、hippeastrie、2a-hydroxy-6-O-methyloduline、2a-methoxy-6-O-methyloduline等生物碱成分。(2)建立活性成分含量检测方法、优化提取制备工艺,以1kg原料验证最佳工艺,结果表明,9-甲氧基喜树碱的最佳提取工艺为：0.35%纤维素酶,pH 6.5,在45℃下提取10h,测得9-甲氧基喜树碱、喜树碱含量为0.151%和0.613%,纯化后得到纯度均为98%的9-甲氧基喜树碱85.60 mg和喜树碱132.45 mg,提取制备工艺稳定,极可能替代喜树成为我国喜树碱的主要来源。(3)对分离自黄花石蒜和臭马比木的6个化合物及DELA进行流式细胞分析,结果表明,9-甲氧基喜树碱诱导癌细胞早期凋亡率显著高于其他成分,凋亡率为66.46%,其次为DELA,凋亡率为30.71%。MTT法测得9-甲氧基喜树碱的IC50为0.385μM, DELA对小鼠S180腹水瘤细胞也具有显著的抑制作用。(4)采用quantitative Real-time PCR分析9-甲氧基喜树碱处理的小鼠S180腹水瘤细胞中表明,Bax mRNA水平显著上升,Bcl-2蛋白水平呈下降趋势,导致Bax/Bcl-2比例显著上升,首次发现9-甲氧基喜树碱具有调节细胞凋亡信号Bax/Bcl-2上升引起癌细胞凋亡。基于9-甲氧基喜树碱具有显著靶向诱导癌细胞凋亡作用和抗癌活性,其有望发展成为抗癌新药。(5)采用Western bloting分析发现,Bax的蛋白水平呈递增趋势,Bcl-2的蛋白水平呈递减趋势,导致Bax/Bcl-2的比率升高,Cleaved caspase-3出现并呈上升趋势。本实验结果表明,黄花石蒜中DELA含有lycorerine结构类型石蒜生物碱也能诱导癌细胞凋亡。体内实验研究表明,低中高剂量组DELA对小鼠S180肉瘤肿瘤抑制率依次为27.90%、37.21%、53.49%；高剂量组的胸腺指数和脾脏指数为(2.98士0.61)mg/g、(9.95士1.87)mg/g,均显著高于CTX组,是对免疫系统毒性小的显著抗癌物质,也有望发展为抗癌新药。