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目的:课题组在前期国家“重大新药创制”课题中“中药5类抗癌新药白头翁皂苷及其制剂的研发”(项目编号:2011ZX11102-001-19)研究过程中发现白头翁总皂苷具有较强的抗肿瘤活性,其中含量最高的白头翁皂苷D(Pulsatilla saponin D,PSD)亦表现很强的抗肿瘤作用。近年来白头翁提取物及有效成分抗肿瘤研究已成为众多科研工作者研究热点之一,目前研究仅局限于药理活性研究,国内对活性成分PSD的成药性研究迄今未见全面、系统、详细的报道,且未见其相关的制剂研究和产品上市。因此,本文拟在综述和总结前人研究工作的基础上,首次对PSD的制备工艺、活性、质量控制、制剂以及体内外过程等进行较为系统的研究,目的为PSD的成药性提供实验支撑和奠定基础。方法:针对中药皂苷类成分紫外吸收特点,首次利用DAD和ELSD两种检测器,建立PSD高效液相含量测定方法;采用单因素和正交试验法相结合,优化PSD制备、精制纯化工艺参数;采用MTT法和在体法评价PSD抗肿瘤活性,从诱导肿瘤细胞凋亡和诱导肿瘤细胞自噬两个方面对其抗肿瘤作用机制进行初步的探讨;采用高效液相法测定PSD的油水分配系数、平衡溶解度和白蛋白结合率等重要理化参数;采用单向灌流法和外翻肠囊法体内外评价方法研究PSD在大鼠肠道吸收行为,采用LC/MS/MS法评价PSD大鼠体内药动学行为;利用制剂手段提高PSD生物利用度和降低其溶血性。结果:建立了 HPLC法测定PSD含量,并运用该分析方法测定了 10个不同来源白头翁药材中PSD的含量,发现各地药材含量参差不齐,吉林产地的含量最高为0.25%,安徽和浙江未检出,确定了从含量最高的吉林白头翁中制备PSD。确定了 70%乙醇提取(加8倍量提取三次每次1小时)、碱水解(pH11～12,90～100℃,5～7小时)、D101大孔吸附收集70%乙醇洗液等关键提取精制控制参数,所得PSD样品纯度>90%。MTT法研究PSD对A549等12种肿瘤细胞均表现较强的肿瘤抑制活性,对人结直肠腺癌细胞HT-29作用最强,IC50为3.76μg/mL。H22荷瘤小鼠肿瘤模型验证了体内抗肿瘤活性较强,且呈一定的剂量依赖性。诱导肿瘤细胞凋亡和诱导肿瘤细胞自噬两个方面结果初步表明PSD是通过增强Caspase3蛋白和LC3-Ⅱ蛋白的表达实现达到抗肿瘤作用。确定PSD为无定型粉末。研究发现在不同溶剂和缓冲盐溶液中PSD平衡溶解度差异性较大,在甲醇最大为255.89 mg/mL,在水中溶解度为2.38 mg/mL,随着pH值升高其溶解度不断增大;油水分配系数测定结果表明PSD亲脂性较强,在水中油水分配系数为0.7;发现PSD与不同属血浆蛋白结合率均较高,与人血浆白蛋白结合率近70%。PSD的体外溶血浓度在2.5μg/mL以下时无溶血现象产生。PSD在大鼠肠道吸收行为研究结果表明其最佳吸收部位为结肠段,转运方式以被动扩散为主。建立了以三七皂苷R1为内标的血浆样品中PSD LC-MS/MS分析方法。采用非房室模型统计分析了 PSD在大鼠体内的药动学参数变化,灌胃高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)各剂量组平均药时曲线都呈现双峰现象,PSD达峰时间约为30min说明大鼠肠道吸收较快,T1/2约为20h说明在大鼠体内代谢较慢,给药剂量与药时曲线下面积、达峰浓度呈线性相关(r2分别为0.9999和0.9952),且高、中、低三个剂量组的半衰期数据显示无统计学差异性,提示PSD在大鼠体内的动力学行为基本符合线性动力学过程;尾静脉给药(3mg/kg)其在大鼠体内分布极快,1min内血药浓度达到峰值,消除也快,PSD绝对生物利用度小于0.1%。采用固体分散体、环糊精包合和白蛋白纳米粒三种制剂手段提高其生物利用度和降低其溶血性。首先,考察了 PVPk30、F68、PEG6000三种固体分散体载体材料及比例对PSD溶解度的影响,结果表明与PEG6000比例为1:6时溶解度达到最大为7.06mg/mL,对比了 PSD形成固体分散体前后溶出行为、在体肠吸收和药动学的变化情况,结果表明加快了溶出速率,吸收参数Papp和Ka值均增大了近3倍,相对生物利用度提高了 224%。其次,确定了羟丙基-β-环糊精最佳的包合工艺参数是HP-β-CD与PSD比例为10:1、包合温度为45℃、包合时间为6h,对包合物形成前后溶解度、溶出行为和药动学进行了研究,结果表明制成包合物后平衡溶解提高至10.58 mg/mL,药物的溶出加快,相对生物利用度提高了 264%。最后,研制了 PSD白蛋白纳米粒,初步确定了羟丙基-β-环糊精包合物与牛血清蛋白最佳比例为5:1,乙醇用量为15mL,交联剂为0.25%戊二醛用量为75μL,交联12小时,测得PSD纳米粒总包封率达90%,收率亦可达到90%,采用激光粒度仪测定了纳米粒平均粒径范围为180.8nm,PDI值为0.226,表明白蛋白纳米粒已基本形成,并对纳米粒的溶血浓度和药动学进行了研究,发现体外无溶血浓度由2.5μg/mL 提高至 8μg/mL。结论:通过上述研究,确定的PSD精制纯化工艺简单、环保、稳定,体内外药效均表明PSD具有较强的抗肿瘤活性,制剂学生特参数表明PSD属于低溶解、高渗透性、生利用度低和溶血性强的药物,固体分散体与环糊精包合物均使PSD生物利用度提高了 2倍多,白蛋白纳米粒使PSD溶血性降低了 3倍多,上述研究结果初步表明PSD成药性风险性较大。