肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌，占肝癌发病的70％～80％，同时也是全球第六大常见恶性肿瘤，其患者病死率位居肿瘤第三位。目前临床肝癌治疗主要以手术切除肿瘤组织、放疗和化疗为主，但存在治愈率低，患者痛苦大等问题。因此深入了解肝癌发病的分子机制对获得更加有效的诊断和治疗方法显得极为重要。　　RYBP蛋白是多梳蛋白复合物(Polycomb Group，PcG)中的一个组分，同时RYBP可与其它分子，如Hippi、Caspase-8，MDM2等相互作用，进而参与胚胎存活、胚胎发育和分化、功能性胚外结构的建立、表观遗传调控和促进细胞凋亡等过程。研究发现，RYBP在多种肿瘤中的表达降低，且RYBP基因的缺失和蛋白的低表达与病人的药物治疗效果及预后有密切关系。过表达RYBP不仅能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭能力，同时增强某些抗肿瘤药物或活性分子的抑瘤效果。已有报道RYBP蛋白在肝癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织，同时本课题组的前期研究发现RYBP的mRNA在随机检测的六例肝癌组织中的表达低于癌旁正常组织。因此，RYBP可能是一个潜在的肝癌抑制因子，在肝癌的发生与发展中发挥重要作用，但RYBP在肝癌细胞中的表达调控及在肝癌组织细胞中表达降低的分子机制尚未见有报道。　　本研究首先从一株正常肝细胞(IHH)和四株肝癌细胞（HepG2，SK-Hep-1，Huh7和PLC/PRF/5）出发，利用qRT-PCR和Western blot方法筛选得到两株RYBP表达显著降低的细胞株，即Huh7和PLC/PRF/5。我们后续的研究就是利用这些细胞，探讨RYBP在肝癌细胞中表达降低的分子机制。由于人类基因组计划公布的序列中存在RYBP转录起始位点附近序列的不完整，因此，本研究首先克隆测序了IHH细胞中的该段缺失序列，在此基础上分析了围绕转录起始位点上下游各约1000 bp的DNA序列特征，发现该段序列具有很高的GC含量，在转录起始位点上游和第一内含子分别有一个CpG岛。我们以这两个CpG岛为启动子区存在的重要标志，克隆测序了其它四株肝癌细胞的-711～+1040 bp为假设的启动子区序列。序列分析和启动子活性结果表明，克隆的该段序列具有显著的转录活性，但五株肝细胞中该段启动子区个别位点序列的突变和/或多态性与RYBP表达水平的变化间无相关关系，说明启动子区序列突变和/或多态性不是RYBP表达水平差异的原因。其次，我们从表观遗传调控的DNA甲基化调控方面，研究RYBP启动子区CpG岛的甲基化水平与肝癌细胞中RYBP表达水平的相关关系。为此目的，我们利用重亚硫酸盐测序PCR及甲基化特异性PCR方法分析了五株肝细胞两个CpG岛的甲基化程度，初步确定DNA的甲基化水平改变不是部分肝癌细胞中RYBP蛋白表达降低的主要原因。接着，我们从另一个角度——特异的转录因子表达水平或活性的改变，探讨人正常肝细胞和肝癌细胞中RYBP蛋白表达水平差异的分子机制。这部分工作通过生物信息学方法结合启动子区不同长度片段的报告基因活性分析、候选转录因子的功能及在肝癌组织细胞中的表达水平等，从7个候选转录因子中最终筛选出对RYBP启动子活性影响最显著的两个转录因子KLF4和Sp1，并通过双荧光素酶报告基因实验验证这两个转录因子对RYBP启动子活性的调节，利用实时定量qPCR、Western Blot，siRNA干扰和染色质免疫共沉淀和转录因子结合位点突变分析等实验证明KLF4和Sp1结合RYBP启动子区，分别从正和反两个方面调节RYBP的表达水平。本论文为进一步研究基于RYBP的肝癌诊断标记物和/或治疗靶点奠定了基础。