论文部分内容阅读
目的:肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）主要负责机体的体液调节。循环系统中的肾素主要是肾近球细胞合成分泌的一种酸性蛋白酶,经肾静脉进入血,进而启动RAS的一系列链式反应。对心血管功能稳态、电解质和体液平衡的维持、血压的调节等均有重要作用。随着分子生物学技术的发展,近年来发现消化道、骨骼肌、脑等多种器官组织中均有肾素和血管紧张素原基因的表达,且这些组织中富含血管紧张素转换酶（angiotensin-convertingenzyme,ACE）和血管紧张素II（angiotensin II,AngⅡ）的受体,同时AngⅡ参与炎症反应及许多器官组织修复和纤维化的调节,从而证实除循环系统的RAS外,这些器官组织中还存在相对独立的局部RAS,它们通过旁分泌和/或自分泌方式直接调节各器官组织的生理病理活动。肠道是摄取吸收液体和电解质的基础,肠道具有复杂的组织结构,包括丰富的平滑肌肉组织,运输离子和液体的上皮细胞和宿主防御细胞。作为体液平衡调节因素的RAS,有可能以肠道为靶点调控其相关的病理生理过程。炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是受遗传物质调控,由抗原刺激和免疫系统激活引发的,多因素互相作用所致的一种肠道非特异性炎症性疾病。比较公认的病理过程是由于各种致病因素导致肠道上皮屏障功能受损,上皮层渗透性增加,致使肠道内有害物质进入肠壁,刺激如淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞聚集并产生大量的炎性介质,产生不可控的级联放大反应,最终导致IBD发生。维生素D具有广泛的生理功能,通过与维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）结合发挥作用。VDR属于核受体超家族,在肠上皮中大量表达。维生素D水平不足或缺乏与IBD密切相关,在确诊及新发的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,DC）患者都出现不同程度的维生素D缺乏,而补足维生素D可以延缓IBD的发展。循环中RAS活性与体内维生素D水平密切相关。维生素D是肾素的有效内分泌抑制剂,参与调节RAS介导的病理生理过程。RAS的激活能促进结肠炎,AngⅡ通过促进肠上皮细胞凋亡和粘膜辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）反应,在结肠炎的发展中起到促进结肠粘膜炎症的作用。以上这些说明IBD中激活了RAS,维生素D缺乏症加剧了结肠炎的发展,但是就IBD的发病机理而言,结肠局部RAS和维生素D之间的关系尚不清楚。因此,本研究的目的是模拟正常机体维生素D缺乏的状态下,探讨维生素D是否通过抑制结肠局部RAS,减轻小鼠结肠炎。研究方法:1.动物实验:常规饲料及维生素D缺乏饲料饲养的C57BL/6小鼠8 w后,分为8组:常规饲料饲养对照组（VDS Ctrl）、模型组（VDS TNBS）、氯沙坦低剂量组（VDS TNBS+Llo）、氯沙坦高剂量组（VDS TNBS+Hlo）;维生素D缺乏饲料饲养对照组（VDD Ctrl）、模型组（VDD TNBS）、氯沙坦低剂量组（VDD TNBS+Llo）、氯沙坦高剂量组（VDD TNBS+Hlo）。模型组及氯沙坦组用丙酮:橄榄油:三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS）混合液进行小鼠背部致敏,8 d后TNBS制备小鼠溃疡性结肠炎模型,观察造模后小鼠的行为状态、称体重,比较实验组与对照组体重下降指数、结肠的大体评分;Elisa法检测小鼠血清25羟基维生素D3[25-（OH）D3]水平;Western blotting检测小鼠结肠粘膜中调节上皮紧密连接的肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）、凋亡相关的PUMA（p53-upregulated modulator of apoptosis,PUMA）及RAS相关蛋白Renin、AT1R、angiotensinogen（AGT）的表达,Real-time PCR检测小鼠结肠粘膜中炎症相关的细胞因子Tnfa,Il1b,Ccl2,Il6,Il17,Il23a mRNA的表达,FITC-右旋糖酐渗透试验、Ussing chamber实验检测小鼠结肠粘膜通透性;HE染色观察结肠组织的病理变化。2.细胞实验:LPS或TNF-α（100ng/ml）预刺激人结肠癌细胞（HCT116）12 h、20 h后,或给予1,25（OH）2D3预处理12 h再进行LPS或TNF-α刺激12 h,收集细胞,Real-time PCR检测Ren、Agtr1、Agt mRNA的表达;Western blotting检测Renin、AT1R、AGT蛋白的表达量。3.统计分析:应用SPSS22.0软件进行实验数据分析,实验数据用Mean±S.E.M表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果:1.维生素D缺乏加重小鼠溃疡性结肠炎:与VDS TNBS组比较,VDD TNBS组小鼠体重下降比例更大、死亡率增加、临床指数增大;小鼠结肠粘膜组织中炎症相关的细胞因子（Tnfa,Il1b,Ccl2,Il6,Il17,Il23a）mRNA表达升高更明显;MLCK及PUMA蛋白表达量增加幅度大;小鼠结肠上皮通透性增加;结肠组织破坏最严重,结肠上皮粘膜溃疡面积大且累计粘膜下层或达到肌层,甚至有粘膜组织完全被炎症细胞浸润代替。2.维生素D缺乏激活溃疡性结肠炎小鼠结肠局部RAS的表达:与VDS TNBS组相比,VDD TNBS组小鼠结肠粘膜组织中Renin、AT1R、AGT蛋白表达量更高,给予氯沙坦阻断RAS后,小鼠溃疡性结肠炎减轻,与模型组比较,体重下降比例减小,死亡率降低,结肠粘膜溃疡面积减小,结肠通透性降低,RAS相应蛋白表达量下降。3.维生素D对HCT116细胞RAS表达的影响:LPS或TNF-α（100 ng/ml）预刺激HCT116细胞12 h、20 h后,Ren、Agtr1、Agt mRNA表达增加;Renin、AT1R、AGT及PUMA蛋白表达增加。给予1,25（OH）2D3后,Renin、AT1R、AGT及PUMA蛋白表达下降。结论:体内外实验均表明,RAS在炎症状态下表达增加,维生素D缺乏状态下TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状更严重,结肠局部RAS表达升高更明显,而这种结果可能与维生素D抑制RAS减少,致使小鼠结肠局部RAS高表达相关,给予氯沙坦阻断RAS后,小鼠溃疡性结肠炎减轻,说明维生素D可通过影响结肠局部RAS的表达调节小鼠溃疡性结肠炎的发生发展。