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大黄鱼(Largeyellow croaker,Lyc)是我国重要的海水经济养殖鱼种。随着大黄鱼养殖产业的快速发展,海水中的细菌、病毒及寄生虫引起的病害问题日益严重,导致了巨大的经济损失。然而,目前对于大黄鱼抵御这些病原体的免疫反应所涉及的分子机制还知之甚少,也因此阻碍了人们采取有效的防御手段来保护大黄鱼免受侵害。
众所周知,细胞系是研究免疫基因和免疫机制的有效途径之一。然而到目前为止,来源于海洋鱼类的细胞系相对于淡水鱼类来源的细胞系数量要少得多,其应用更是远远不足。本文用胰酶消化法启动了大黄鱼心、肝、脑、肾四种细胞系的原代培养。在原代培养初期,四种细胞均呈成纤维状,都能在15天内增殖并汇合成单层,在之后的传代培养中也保持了良好的生长状态。迄今为止,四种细胞均培养超过400天,其中脑细胞和肾细胞已生长至90多代,心细胞和肝细胞也生长至50多代。我们对这四种细胞进行了初步的质粒转染实验,并从中检测到了多种大黄鱼免疫相关基因,如TLR1、TLR2、TLR5S、TLR13、IL-6、IL-8a和IL-8b。在受到细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、poly(I:C)、肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)等的免疫刺激后,细胞内下游的一些免疫相关基因如TLR1和IL-8b等,表达水平发生了显著变化。这些研究初步表明,四种细胞可应用于大黄鱼的分子免疫学研究中。
病原体入侵机体时,Toll样受体能够激活相应的免疫反应。本研究中,我们根据大黄鱼嗜水气单胞菌诱导12h的脾脏转录组文库信息,得到了3个新的Toll样受体基因(Toll-like receptor,TLR),LycTLR1,LycTLR2和LycTLR5S。3个TLRs的全长分别是2409nt,2451nt,1926nt,依次编码802aa,816aa,641aa的蛋白。LycTLR1和LycTLR2蛋白具有典型的Toll样受体结构域:胞外段有数个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-richrepeats,LRR)以及一个C-端LRR序列,胞内段有一个保守的Toll/IL-1受体区域(Toll/IL-1 receptor domain,TIR)。而LycTLR5S是鱼类所特有的一种可溶性的Toll样受体,缺乏典型的TIR结构域及跨膜区,仅存在LRR区域。基因组结构分析表明,LycTLR1由2个外显子和1个内含子组成,LycTLR2由11个外显子和10个内含子组成,与几种近缘硬骨鱼类的TLR基因组结构相似。受三联疫苗及poly(I:C)刺激后,TLR1和TLR2的表达水平在脾脏组织中均发生下调,TLR5的表达水平在脾脏组织中则发生上调,在肾脏组织中受poly(I:C)刺激后LycTLR1和LycTLR2的表达水平均上调,这表明它们在肾脏组织内的免疫反应中可能发挥了重要作用。
趋化因子是一类具有趋化性的细胞因子,根据四个保守的半胱氨酸残基中前两个的位置将它们分成了四个亚家族:CXC(α)、CC(β)、C和CX3C。本研究通过RACE-PCR(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了2个新的CXC型趋化因子,LycIL8a和LycIL8b(Interleukin,IL)。二者的cDNA全长分别为285nt和300nt,编码94aa和99aa的蛋白。基因组结构分析表明,二者均由4个外显子和3个内含子组成,基因组结构基本一致。这两个IL8基因在大黄鱼所有受试组织中均是组成型表达。受poly(I:C)刺激后,在脾脏组织中二者的表达水平都发生下调,而在肾脏组织中则均发生上调,这暗示它们可能主要是在机体抗病毒反应中发挥作用。重组表达的LycIL8a和LycIL8b蛋白对大黄鱼外周血淋巴细胞(Peripheral blood leucocytes,PBLs)均具有典型的趋化活性。