研究背景：骨肉瘤生长快增殖迅速,生长方式呈浸润性生长破坏周围正常组织。骨肉瘤恶性程度高而且进展快,早期即易发生血道转移且易发生肺转移,复发率高,预后较差。目前尚无有效的治疗手段将之完全治愈。因此,该疾病严重威胁着人们的生命健康。对于骨肉瘤的研究,人们已经在分子水平取得了长足的进步,找到了一些骨肉瘤发生发展的相关基因,其中就包括对与骨肉瘤相关的miRNA的研究。microRNA是19-25个核苷酸组成的内源性非编码RNA,它与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)通过碱基序列互补特异性结合,进而抑制靶基因蛋白质翻译。现已在人体细胞中发现了数百种miRNA,广泛参与增殖、凋亡、发育、分化等过程的基因表达调控,并与包括肿瘤在内的多种人类疾病的发生密切相关。目前在骨肉瘤中已筛选出一些表达异常miRNA s。其中,在骨肉瘤中miR-34家族成员表达降低,而miR-34家族可通过一种p53依赖方式影响靶基因的表达。miR-34c通过抑制Notch信号途径抑制成骨细胞分化,促进骨肉瘤发生。在骨肉瘤中miR-24过表达,通过调节溶血磷脂酸酰基转移酶β(lysophosphatidic acid acyltransferaseβ,LPAATβ)基因表达参与骨肉瘤发病。miR-16可以抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶(Rafl-mitogen-activated protein kinase, MAPK)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路,沉默胰岛素样生长因子-1受体(Insulin like growth factor-1 receptor, IGF1R),抑制细胞生长。在骨肉瘤中,miR-16表达下调。miR-148a是miR-148/152家族成员之一,已有研究显示,miR-148a在肿瘤细胞增殖和癌症侵袭过程中起着重要的作用,并且在不同的肿瘤组织中表达具有特异性。有研究采用高通量的microRNA表达谱芯片的方法研究骨肉瘤组织中异常的microRNA表达谱,结果显示,骨肉瘤组织中存在有数十个显著表达差异的microRNA,其中包括niR-148a。本研究的前期实验也表明：miR-148a在骨肉瘤中的表达较癌旁非肿瘤骨组织的表达明显上调,并且在转移组中的表达明显高于非转移组。由此说明,miR-148a可能在骨肉瘤的发生发展特别是肿瘤细胞转移过程中起着重要作用,但其可能的生物学功能和机制尚不完全明确。miRNAs不仅在实体肿瘤中发挥着重要的调节作用,而且可被释放入血成为肿瘤特定的标记物。在胃癌患者血清中,有许多miRNAs出现表达水平的上调或下调,其中,miR-184表达水平最高,而对胃癌患者进行手术治疗后,miR-184表达水平即明显下降。在前列腺癌患者外周血中,miR-141表达明显升高,可用于筛查前列腺癌患者和正常对照组。而miR-148a是否在骨肉瘤患者的外周血中表达异常还尚不明了,其是否能够成为外周血中的骨肉瘤标记物值得探讨。研究目的：本研究探讨miR-148a与骨肉瘤的关系,揭示miR-148a在骨肉瘤中的表达与骨肉瘤临床病理参数之间的关系,为深入了解miR-148a与骨肉瘤的发生发展提供理论依据；分析骨肉瘤患者外周血中miR-148a的表达与患者临床病理资料之间的关系,为miR-148a作为骨肉瘤的外周血标记物提供实验基础；证实miR-148a在骨肉瘤发生发展中的生物学功能,明确miR-148a是否对骨肉瘤的转移具有调节作用并筛选miR-148a调节的靶基因,为骨肉瘤的治疗提供实验依据。研究方法：(一)在骨肉瘤组织中以RT-qPCR的方法检测miR-148a的表达情况,分析其与临床病理参数的关系。征求骨肉瘤患者同意,收集骨肉瘤及非肿瘤骨组织的手术后的石蜡标本。经病理诊断为骨肉瘤并且完好保存的标本经切片、脱蜡并准确刮取骨肉瘤癌组织部分,加入提取试剂按照说明操作将组织中的miRNAs抽提。经过分光光度仪测定RNA的浓度和纯度以后保存待用。将提取的RNA逆转录,经RT-qPCR检测miR-148a表达的情况。结合随访数据分析miR-148a与临床病理参数的之间的关系。相应的临床病理参数包括性别,年龄,肿瘤大小,肿瘤分期,组织学类型,肿瘤定位,转移、复发生存分析和单／多因素分析。(二)检测骨肉瘤患者血清中miR-148a的表达,分析其与临床病理参数的关系。征求上述骨肉瘤患者同意,在收集骨肉瘤组织标本的同时抽取患者外周血5ml,12000转／分高速离心,将分离后分离的血清储存于-80℃保存待用。抽取健康人志愿者外周血按上述方法处理保存,作为对照样本。将血清中加入Trizol试剂,按照说明操作提取血清中RNA。将提取的RNA逆转录,经RT-qPCR检测血清中miR-148a表达的情况。结合随访数据分析miR-148a与临床病理参数的之间的关系。相应的临床病理参数同骨肉瘤组织中分析miR-148a表达模式的参数,揭示其在外周血中肿瘤标记物的功能。p(三)在体外验证miR-148a对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。将骨肉瘤细胞种植于12孔板中,贴壁后转染miR-148a前体pre-miR-148a及对照片段Negative control;转染后24、48及72小时候收集转染的细胞对miR-148a的转染效率进行检测。证实能够成功过表达miR-148a后,将细胞于转染后24小时进行Transwell实验,在体外细胞学水平证实miR-148a对骨肉瘤细胞迁移和浸润能力的影响；同时进行MTS实验在24,48和72小时检测miR-148a对细胞增殖能力的影响。(四)验证miR-148a调控的直接靶基因。构建SMAD2和CHD1的3’-UTR双荧光素酶载体建。将骨肉瘤细胞种植与12孔板中,贴壁后分别共转染pre-miR-148a+双荧光素酶载体及pre-miR-NC+双荧光素酶载体；48小时后收取细胞裂解液检测实验组和对照组双荧光素酶表达差异,鉴别受miR-148a直接调控的靶基因。结果：(一)miR-148a在骨肉瘤组织中的表达及与临床病理资料的关系。将收集的标本经过处理之后,RT-qPCR方法检测niR-148a在106例骨肉瘤组织及89例非肿瘤组织中的表达,在经过统计软件的对其与临床病理参数经行分析,结果显示相对于非肿瘤骨组织miR-148a在肿瘤组织中呈现明显高表达,并且miR-148a在40例发生转移的骨肉瘤组织样本中的表达明显高于56例非转移性骨肉瘤组织中的表达；miR-148a在≥20岁年龄组患者的骨肉瘤标本中明显高表达。而miR-148a在性别,肿瘤大小,肿瘤定位,组织学类型及对化疗反应的不同样本中表达无明显差异；相对于存活的患者,miR-148a在已经死亡的患者中表达上调,生存分析显示miR-148a高表达的骨肉瘤患者具有更短的总体生存时间和肿瘤特异性生存时间；多因素分析显示miR-148a的表达高低以及转移与否是骨肉瘤患者总体生存和肿瘤特异性生存的独立预后因素,肿瘤大小还在总体生存的单因素分析和多因素分析中具有统计学意义。(二)miR-148a在骨肉瘤患者外周血中的表达及与临床病理资料的关系。RT-qPCR检测分析显示miR-148a在骨肉瘤患者的外周血中的表达较健康人外周血中的表达明显升高,miR-148a还在转移性骨肉瘤患者的外周血中的表达进一步升高。分析还发现相对于对化疗反应差的病例,miR-148a还在对化疗反应较好的患者外周血中的表达明显上调。miR-148a在死亡组的患者外周血中的表达明显增加,生存分析证实外周血中的miR-148a高表达患者同样有着较差的总体生存和肿瘤特异性生存预后。外周血中miR-148a的表达高低是总体生存和肿瘤特异性生存的独立预后因素。(三)miR-148a在骨肉瘤组织和对应的外周血中的表达成正相关。将RT-qPCR检测miR-148a在106例骨肉瘤组织中的表达和其在对应的外周血中的表达做相关分析,结果揭示两者的表达呈明显的正相关关系。(四)miR-148a促进骨肉瘤细胞的迁移和浸润能力。将miR-148a转染进入骨肉瘤细胞系U-2 OS,检测发现该方法能够成功实现对miR-148a的过表达。Transwell迁移实验和浸润实验证实过表达miR-148a的骨肉瘤细胞穿过小室的能力均明显增加,说明miR-148a能够明显促进骨肉瘤细胞的迁移和浸润能力。MTS实验证实miR-148a对骨肉瘤细胞的增殖能力无明显影响。(五)miR-148a直接调控靶基因SMAD2。软件预测出miR-148a可能的靶基因SMAD2、CHD1、MED12L及ZNF217,经过双荧光素酶验证SMAD2受miR-148a的直接调控。结论：我们的研究证实了miR-148 a在骨肉瘤组织和患者外周血中的表达上调,并均在转移组中的表达进一步上升；高表达的miR-148a骨肉瘤患者有着较差的5年生存预后,同时在骨肉瘤与外周血中高表达的miR-148a和远处转移是骨肉瘤患者的两个独立预后因素;miR-148a在骨肉瘤中的表达和其在患者外周血中的表达具有很好地相关性；因此,miR-148a可以在骨肉瘤患者外周血中成为良好的肿瘤标记物和患者较好的预后指标。miR-148a能够促进骨肉瘤细胞的迁移和浸润能力,并且可能通过直接调节靶基因SMAD2发挥调节骨肉瘤发生发展的作用。这为骨肉瘤的治疗提供了潜在的新治疗靶点,对与骨肉瘤患者具有重要的意义。