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巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白真核表达系统之一,该系统基于一个高效的醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子(AOX1promoter,PAOX1),PAOX1的转录只响应甲醇的诱导,当以甲醇为唯一碳源时,PAOX1启动外源蛋白的表达,当甘油存在时,甘油阻遏aox1的转录。本文分析了毕赤酵母gup1基因(PpGUP1,基因编号:238029505)在代谢甘油和甲醇中的作用,通过基因敲除、异源表达和基因过表达,构建了不同突变体,在不同碳源培养基培养,生物量、碳源代谢速率分析,并从转录水平分析不同碳源培养基中基因的特异性表达,以期探究甘油抑制PAOX1的分子机理。主要研究结果如下:(1)同源重组构建PpGUP1缺陷型菌株GUP1Δ和过表达菌株分别在BMGY、BMMGY培养基培养,甘油利用缺陷型粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中异源表达PpGUP1后在以甘油为唯一碳源的培养基培养。生物量及上清甘油含量对比分析,GUP1Δ与P.pastoris生物量及甘油代谢水平无显著性差异,PpGUP1过表达后生物量提高5%,甘油平均代谢速率提高8%,S.pombe中异源表达PpGUP1基因后不能恢复对甘油的利用,通过SDS敏感性实验分析,GUP1Δ细胞透性增强。实验结果表明,毕赤酵母PpGUP1不是甘油转运体,其通过提高细胞透性间接提高甘油吸收速率。(2)在BMMY培养后发现,GUP1Δ较P.pastoris生物量降低约30%,甲醇代谢水平显著降低。SDS-PAGE,Western blot检测AOX1蛋白表达,结果发现GUP1Δ菌株AOX1蛋白的甲醇诱导表达水平显著差于P.pastoris菌株,同时酶活低约50%,PpGUP1过表达后生物量提高6%,AOX1酶活提高10%。进一步分析在不同碳源培养过程中gup1、mxr1和aox1基因的转录水平,敲除PpGUP1后,aox1的基因转录水平显著降低,同时检测mxr1的转录水平下降50%左右,但弱于aox1。PpGUP1在野生菌中过表达后,mxr1和aox1的转录水平均有一定提高。PpGUP1缺失抑制甲醇代谢,推测PpGUP1有两种可能对aox1的调节:一是PpGUP1直接调控aox1的转录;另一种是PpGUP1通过调控mxr1的转录间接调控aox1,这种调控更为严谨。