糖尿病是对现代人健康威胁最大的疾病之一。对糖尿病多年的研究取得了一些成果，但仍然有许多未解决的问题，糖尿病的发病机理、对患者机体的损伤机制、高血糖对患者的病理影响、胰岛素抵抗的机制都没有完全明了，也没有找到较好的根治方法。在糖尿病患者中，血液是病理作用的重要靶组织，患者血液长期处于高血糖、胰岛素分泌紊乱等特征病理条件下，这很可能引起红细胞膜蛋白的损伤或改变。随着蛋白质组学技术的发展，及其在疾病研究中的应用，越来越多的研究者利用蛋白质组学的分析方法，来探索各种人类疾病的分子机制；寻找引起疾病的关键蛋白质；筛选对疾病的诊断、治疗、预后和新药开发都有重要意义的标记分子。为了探索2型糖尿病病变机制，结合本实验室在蛋白质组学方面已经开展的工作和实验条件，本文从比较蛋白质组学的角度，比较正常人和糖尿病人红细胞膜蛋白及膜Lipid rafts蛋白的表达变化情况，以期找到在糖尿病患病过程中起关键作用的蛋白质，为糖尿病临床诊断、治疗和预后检测提供可利用的分子标记，并在此基础上进一步探讨糖尿病的病变机制。用2DE／MS方法进行红细胞膜蛋白质组学分析，首要要解决的关键是高效和高质量的膜蛋白的分离，我们在整个实验中，选择了多种去垢剂，尝试不同的配方来提取完整的红细胞膜蛋白质，经过对比及抽提方法和上样、聚焦条件的优化，选择0.5％ASB14，5M尿素，2M硫脲，50mM DTT作为膜蛋白的溶解液；使用了17cm的非线性预制胶条，等电聚焦60，000vhr；得到重复性较好，分辨率较高—分离得到600个左右的蛋白质点的二维电泳图谱。利用PD-Quest软件分析比较正常人和糖尿病人红细胞膜蛋白二维电泳图谱的差异，发现表达水平有显著性差异(P＜0.05)的蛋白质42个，其中27个蛋白质点的表达在糖尿病人中升高，15个则降低。对这些候选蛋白质进行选择，取3个蛋白质点进行基质辅助激光解析电离—飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析，得到蛋白质的肽指纹图谱，并在网上数据库进行搜索，鉴定得到了这些蛋白质分别是：Syntaxin 1 C；Flotillin-1；Arginasel。对这些在糖尿病人红细胞膜上发生差异的蛋白质进行分析。Syntaxin 1在细胞中与囊泡和质膜的融合有关，细胞中GLUT4转运到质膜上在肌肉和脂肪细胞中主要是依靠囊泡的运输、搭靠和膜的融合，将葡萄糖转运蛋白4(GLUT4，Glucose transporter 4)分子固定在细胞膜上，从而发挥转运葡萄糖及其它糖类的功能；Flotillin-1存在与脂筏上，往往和信号转导分子关联，预示着它在信号转导中起着一定作用，肌肉和脂肪组织中新的胰岛素依赖型的葡萄糖代谢信号转导通路，该通路不依赖于PI(3)K(Phosphatidylinositol-3-OH kinase)，当胰岛素和其受体结合后，通过级联反应，激活CAP(Cbl-associated protein)，但只有当CAP蛋白和Flotillin-1结合并转移到细胞膜的特定区域时，才能与Cbl结合并激活下游反应，最终GLUT4通过胞吐作用与质膜融合并参与葡萄糖运输；Arginasel可通过与一氧化氮合成酶(NOS)竞争底物—L-精氨酸使后者生成尿素和L-鸟氨酸，调节细胞内NO的生成，一氧化氮(NO)是种具有多种信号转导功能的独特分子，NO表达异常和多种疾病相关，如糖尿病、动脉硬化和高血压等。为深入研究Flotillin-1，Arginasel在糖尿病中的机制，我们克隆表达纯化了Flotillin-1，同源蛋白Flotillin-2，Arginasel，及其它红细胞膜蛋白，葡萄糖转运蛋白1(GLUT1，Glucose transporter 1)片断，利用蛋白质—蛋白质相互作用的方法，研究它们之间的相互作用。使用Far-Western和Pull-down assay方法验证了Flotillin-1和Flotillin-2，Flotillin-1和Arginasel存在着直接相互作用。我们观察到除了Cdb3外，红细胞膜上还存在另一条途径将膜和细质相互偶联，即膜上的Flotillin-1能将水溶性的Arginasel带到膜上，并且由此调节后者的活性。同时为了研究它们在细胞内的功能，我们初步尝试在真核体系表达Flotillin蛋白，验证方案的可行性，接着研究蛋白的共定位及性质和功能，对进一步阐明Flotillin-1和Arginasel在糖尿病人红细胞膜上变化机制奠定了基础。脂筏上包含有许多蛋白质，特别是信号转导蛋白，使脂筏具有许多功能：参与信号转导和参与细胞蛋白的运转。我们发现在糖尿病人表达量明显上升的Flotillin-1分布在脂筏上，且葡GLUT1也分布在脂筏上，在糖尿病人中运输功能也发生了很大变化，可能糖尿病人红细胞膜脂筏蛋白发生了各种病理性的变化，因此我们对糖尿病人红细胞膜Lipid rafts蛋白进行蛋白质组学分析，寻找有差异的Lipid rafts蛋白，进一步探索糖尿病人红细胞膜上蛋白的变化。研究结果发现表达水平有显著性差异(P＜0.05)的蛋白质54个，其中18个蛋白质点的表达在糖尿病人中升高，15个降低，10个只在糖尿病人表达，11个只在正常人表达，选择鉴定了部分差异蛋白质：Erythroid protein 4.1 isoform A; MAP kinase-interactingserine/threonine kinase 1; Zinc finger protein 3; Chain A, D34 region Of humanankyrin-R and linker; Stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizingprotein); Transforming acidic coiled-coil-containing protein 1。本文利用蛋白质组学的方法，对糖尿病人红细胞膜上蛋白质变化机制进行了研究，初步阐明了有表达差异的蛋白质在糖尿病病理进程中的重要性和可能作用，并且为下一步的深入研究提供了可能。