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第一部分创伤弧菌溶细胞素体外诱导HUVEC, SGC-7901及SMMC-7721细胞凋亡及其机制研究背景和目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,主要生长于海水中。人类主要因生食污染的牡蛎等海产品或经创口而感染创伤弧菌,引起原发性败血症或严重的创口感染,死亡率高达70%。创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin, VVC)是创伤弧菌最重要的致病因子之一。目前认为,VVC是一种膜成孔毒素,能引起红细胞的渗透性溶解,对肥大细胞、肺内皮细胞和巨噬细胞等则有细胞毒性。亦有报道证实创伤弧菌溶细胞毒素可诱导内皮细胞细胞凋亡。为证明创伤弧菌溶细胞素是否可以通过凋亡方式诱导血管内皮细胞及肿瘤细胞死亡,本研究中,我们采用基因工程技术重组表达了VVC(rVVC),以人脐静脉内皮细胞HUVEC、人胃腺癌细胞SGC-7901及人肝癌细胞SMMC-7721为靶细胞,研究了rVVC对HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721的细胞毒性作用及机制。方法采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA, T-A克隆后测序并构建whA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET-42a-vvhA。采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rVVC, SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统确定rVVC表达量及提取物纯度。采用溶血试验检测rVVC溶解兔红细胞的活性,MTT试验检测rVVC对细胞活力的影响。2,4-二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色法分别测定rVVC作用的HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721细胞培养物上清中LDH和K+含量。通过透射电子显微镜观察rVVC引起的细胞形态变化。采用流式细胞术检测rVVC诱导凋亡的作用。采用caspase3、8、9活性测定试剂盒分别测定rVVC作用后HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721细胞的caspase3、8、9活性。将FITC标记rVVC,采用激光共聚焦技术对作用细胞后的FITC标记rVVC进行定位。结果与GenBank中相关序列比较,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.09%和98.26%。MTT试验结果显示1～100μg/mL的rVVC作用HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721细胞4h后,细胞活力明显下降,呈剂量依赖性。1μg/mL的rVVC即可溶解兔红细胞(P<0.01)。10μg/mL的rVVC可引起HUVEC. SGC-7901及SMMC-7721细胞培养物上清中K+含量明显增高(P<0.01),但LDH含量无明显改变(P>0.05)。10μg/mL rVVC处理HUVEC.SGC-7901及SMMC-7721细胞4h后,细胞出现典型的凋亡特征性形态学改变；流式细胞检测证实rVVC以时间/剂量依赖方式引起上述细胞凋亡。在rVVC诱导的细胞凋亡中,caspase-9和caspase-3被激活,而caspase-8活性无明显变化。在FITC标记的rVVC作用HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721细胞10～240min内,rVVC逐渐从细胞膜表面向膜内侧和胞浆内移行,作用30min时多数rVVC进入细胞。结论rVVC具有溶细胞素活性。诱导HUVEC、SGC-7901及SMMC-7721细胞发生凋亡是其损伤细胞的主要机制,VVC诱导细胞发生凋亡的机制与caspase-9/3途径有关,而与caspase-8无关。VVC在与细胞膜接触后不仅仅是停留在膜表面,而是很快进入细胞浆,在胞内发挥其毒性作用。第二部分钩端螺旋体赖型感染J774A.1和THP-1细胞后胞内游离Ca2+水平变化及其诱导的细胞凋亡背景和目的钩端螺旋体(以下简称钩体)病是一种全世界流行的人兽共患病,致病性钩体侵入人体后能引起能引起急性发热和全身各系统疾病,其最基本的临床症状为出血和黄疸。钩端螺旋体的致病机制至今未明。在很多病原菌-宿主模式系统中,胞内游离Ca2+水平变化是一项非常重要的信号传导机制。业已报道,许多致病菌黏附宿主细胞后能引起胞内游离Ca2+水平升高,从而触发一系列Ca2+依赖信号传导,引起细胞骨架重排,介导细菌内吞。在吞噬细胞对抗病原菌的反应中,Ca2+也是极为重要的第二信使,而病原菌也发展出了多种方式来对抗这些钙依赖性反应,如诱导吞噬细胞凋亡、不被吞噬、从吞噬泡中逃逸,改变胞内途径等。为了了解钩体感染细胞时是否能引起胞内Ca2+水平升高及Ca2+水平变化机制,并进一步了解其引起的胞内Ca2+水平变化与细胞凋亡的关系,本研究采用Fluo-4/AM胞内游离Ca2+荧光染色激光共聚焦技术检测了致病钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞前后胞内游离Ca2+水平变化,并通过各种阻断剂检测了Ca2+来源及阻断前后钩体感染引起的细胞凋亡变化,分析了钩体可能的PLC蛋白并通过基因敲除技术验证其在钩体感染引起的胞内游离Ca2+水平变化中的作用。方法采用Fluo-4/AM胞内游离Ca2+荧光染色激光共聚焦技术观察致病钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞时胞内Ca2+荧光强度实时变化。用胞外Ca2+螯合剂EGTA、胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM、L型钙通道阻断剂维拉帕米、T型Ca2+通道阻断剂米拉地尔、配体门控钙通道阻断剂SKF96365、PLC抑制剂U73122预处理细胞,再用Fluo-4/AM荧光染色激光共聚焦显微镜法检测胞内游离Ca2+水平,以确定各阻断剂对胞内游离Ca2+水平的影响及Ca2+的来源。采用流式细胞术检测致病钩体赖型诱导J774A.1和THP-1细胞凋亡的作用,并用上述阻断剂阻断实验检测胞内游离Ca2+水平与细胞凋亡的关系。通过生物信息学分析,预测钩体PLC相关基因,并构建其原核表达系统,通过HitHunterTM IP3检测试剂盒和NPPC试验对重组蛋白进行PLC活性分析。通过基因敲除技术构建PLC活性蛋白LB361的基因敲除株和补回株,以LB361基因敲除株和补回株感染J774A.1和THP-1细胞检测胞内游离Ca2+浓度变化,以验证LB361基因的作用。结果正常J774A.1和THP-1细胞胞内游离Ca2+基础值分别为99.3+3.7%和105.3+7.7%。问号钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞2h内胞内游离ca2+水平显著升高,感染60min时胞内游离Ca2+水平达到峰值,分别为正常水平的436.9+14.4%(J774A.1)和486.8+20.1%(THP-1)。胞外Ca2+螯合剂EGTA及胞内Ca2+螯合剂BAPTA/AM分别螯合细胞外及细胞内游离Ca2+后,钩体感染引起的胞内Ca2+升高峰值小于未加螯合剂前峰值。SKF96365阻断配体门控Ca2+通道后,钩体感染引起的胞内Ca2+升高被显著抑制。电压门控Ca2+通道阻断剂维拉帕米和米拉地尔分别阻断L型和T型Ca2+通道后,钩体感染仍能引起胞内Ca2+显著升高,只在感染60min时峰值略有降低。PLC抑制剂U73122和新霉素也能显著抑制钩体感染引起的胞内Ca2+升高。钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞后,细胞发生显著凋亡,经Ca2+螯合剂或阻断剂阻断胞内游离Ca2+上升水平后,钩体感染引起的细胞凋亡被显著抑制。通过生物信息学分析,推测了3个钩体PLC相关基因(LA0543、LA2250、LB361),各重组蛋白PLC活性测定结果表明LB361蛋白具有PI-PLC活性。钩体赖型LB361基因敲除株感染J774A.1和THP-1细胞后能引起胞内游离ca2+水平上升,但其峰值显著低于野生株感染引起的胞内ca2+升高,说明LB361基因在钩体感染引起的胞内游离Ca2+升高中有着重要作用。结论钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞引起胞内游离Ca2+水平显著升高,Ca2+水平的升高包含了两个来源,即胞外Ca2+的内流和胞内钙库的释放。胞外Ca2+的内流主要由配体门控钙通道介导,钩体感染细胞后首先经由配体门控钙通道引起胞内游离Ca2+水平上升,继而激活PLC,引起内质网释放Ca2+,使胞内游离Ca2+水平进一步升高。钩体赖型感染J774A.1和THP-1细胞后,细胞发生显著凋亡,与钩体感染引起的胞内游离Ca2+水平上升有关。LB361基因在钩体感染引起的胞内游离Ca2+升高中有着重要作用,高水平游离Ca2+可介导细胞凋亡,钩端螺旋体赖型赖株LB361基因产物为PI-PLC,可水解底物产生IP3而引起胞内结合钙释放,故为钩端螺旋体的毒力因子。