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口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的一种烈性传染病。病毒的衣壳是由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白的60个亚单位组成,其中VP1是诱导动物产生中和抗体的主要成分。FMD一旦爆发,不仅对畜牧业带来极其严重的损失,也会影响社会经济以及政治的稳定。目前FMD的预防主要还是依赖全病毒灭活疫苗,但是疫苗实践当中发现该疫苗仍存在诸多瓶颈问题,例如病毒的纯化工艺繁琐、免疫效果不稳定等。本试验具体研究内容如下：1、本研究对已构建的含有VPl表位肽基因的原核表达载体pGEX-SLP-MultiVPl进行IPTG诱导表达,成功获得了分子量约为80 kDa的嵌入型蛋白。通过Pierce(?) GST Spin Purification Kit亲和层析和切胶相结合的方法,成功纯化出嵌入型蛋白GST-SLP-MultiVPl,并用Prescission Protease切掉嵌入型蛋白中的GST标签蛋白后,获得了目的蛋白SLP-MultiVP1,其大小约为54 kDa。经Western blotting试验结果显示：该蛋白与牛A、0、Asia Ⅰ型疫苗株阳性血清均有特异性的结合,表明本试验正确纯化了嵌入型蛋白SLP-MultiVP1。随后,用该蛋白(浓度约为1.12mg/ml)免疫昆明小鼠3次后第7d采外周血分离血清,经间接ELISA方法检测结果显示：嵌入型蛋白SLP-MultiVP1能刺激小鼠机体产生高滴度的特异性抗体(OD150nm值为2.0以上),为下一步进行该蛋白免疫原性试验奠定了基础。2、将用已纯化的嵌入型蛋白SLP-MultiVP1,免疫接种6周龄昆明小鼠,以重组蛋白SLP与PBS作为对照组。分别在第一次免疫、第二次免疫和第三次免疫后安乐死昆明小鼠,分离其脾脏提取了总RNA,立即反转录成cDNAⅠ采用荧光定量PCR方法,分别检测了IL-4与IFN-γ的表达水平并进行统计学分析。试验结果显示：嵌入型蛋白SLP-MultiVP1免疫组的2种细胞因子表达量高于与其他2个对照组(P<0.05),而且两个对照组间比较,2种细胞因子表达量无显著性差异(P>0.05)。3、将新一批6周龄昆明小鼠随机分组,同样蛋白在第二次免疫后7d,从心脏采取血液。血液样品按既定方法进行处理后,在流式细胞仪中上样分析嵌入型蛋白SLP-MultiVP1对CD4+T和CD4+T细胞的刺激情况并进行统计学分析。试验结果显示：嵌入型蛋白SLP-MultiVP1免疫组的CD4+细胞的单个细胞数量菏于SLP重组蛋白和PBS对照组,差异显著(P<0.05)；而PBS对照组和SLP重组蛋白免疫组之间无显著差异(P>0.05)。并且在外周血中,嵌入型蛋白SLP-MultiVP1免疫组的CD4+T细胞/CD8+T细胞比值均高于SLP重组蛋白免疫组和PBS对照组,差异显著(P<0.05)。本试验为进一步各型FMDV VP1基因表位嵌入型蛋白SLP-MultiVP1的免疫保护试验研究奠定了基础。