背景与目的:随着对PPARs基因的深入了解，PPARγ在肿瘤中的作用日益成为学者们研究的焦点，有不少研究证明，其激动剂在体外研究中能够促进肿瘤细胞的凋亡，但是在体内研究和临床研究中并不能取得相应的效果，特别是在PPARγ表达阳性的肿瘤中效果不明显。为此，本研究选择PPARγ阳性表达的肿瘤细胞系KLE与HEC-1A细胞，利用RNA干扰技术，抑制PPARγ的表达，意在寻找治疗PPARγ高表达肿瘤的一种更好的方法。 方法: （1）PPARγ及α干扰RNA质粒的构建依据Katherine L.Schaefer等人的实验选择干扰的靶点，依据选定的特异序列分别合成两条DNA单链，退火后插入已酶切线性化的载体中，形成重组质粒。采用通用型阴性对照序列同法构建阴性对照载体。 （2）质粒的扩增及鉴定质粒转化大肠杆菌DH5α进行扩增，质粒提取试剂盒提取质粒，用于酶切鉴定和测序。 （3）细胞培养及转染KLE细胞与HEC-1A细胞常规培养。转染过程按照lipofectamine2000说明书操作。转染后荧光显微镜观察，计数转染效率。 （4）Western blotting检测干扰RNA的沉默效率转染后48小时收集细胞，提取总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳，目的条带用AlphaEaseFC软件分析系统进行灰度值分析。PPARγ条带与actin条带吸光度的比值表示蛋白表达量，干扰质粒对细胞目的蛋白表达的抑制率为（1-转染干扰质粒细胞PPARγ蛋白表达的量/转染空载体表达的量）×100％。 （5）四唑盐（MTT）比色试验测定PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1a细胞株生长的抑制作用分别设空白对照组、阴性质粒组、重组干扰质粒组，每组设6个复孔。以转染后24、48、72、96小时为时间点，在酶标检测仪上测定各孔的吸光值，纪录结果。抑制率=（1-处理组/空白对照组）×100％。 （6）Hoecht3222染色法检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1a细胞株的凋亡诱导作用转染后72小时，Hoech3222染色，于荧光倒置显微镜下观测胞核变化。分别取5个高倍镜视野，计数凋亡变化的细胞个数所占比例为凋亡率，取平均值，并与阴性对照组细胞做比较。 （7）Transwell体外侵袭实验检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1a细胞株侵袭力的影响构建体外侵袭试验模型，将转染后24小时的细胞，种于transwell小室的上室，孵育24小时后观察HE染色观察侵袭的细胞数，计算侵袭率与对照组细胞进行比较。 （8）四唑盐（MTT）比色试验检测PPARa干扰质粒对子宫内膜癌细胞的生长抑制作用方法参照“四唑盐比色试验检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞的生长抑制”。 （9）四唑盐（MTT）比色试验检测PPARα干扰质粒与PPARγ干扰质粒共转染对子宫内膜癌细胞生长的影响将转染PPARγ干扰质粒的KLE细胞、HEC-1a细胞行G418筛选后得到稳定细胞株，分别以1.5×105/ml及5×105/ml密度接种于96孔板，培养24h后转染干扰质粒PPARα及阴性对照质粒，空白对照组只加入无血清的培养基。具体方法参照“四唑盐比色试验检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞的生长抑制”。 （10）Hoecht3222染色法检测PPARα干扰质粒与PPARγ干扰质粒共转染对子宫内膜癌细胞凋亡的影响将稳筛后的KLE细胞、HEC-1a细胞以1.5×105/ml及5×105/ml密度接种于6孔板，CO2孵箱终培养，在37℃、5％CO2基饱和湿度条件下，培养24h后转染干扰质粒PPARα及阴性对照质粒，空白对照组只加入无血清的培养基。转染后72小时Hoecht3222染色法检测细胞凋亡。具体方法参照“Hoecht3222染色法检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜细胞凋亡的影响”。 结果: （1）转染后24小时的转染效率在两种细胞种分别可到达69.8％±0.199，70.1％±0.077。 （2）转染48小时后PPARγ干扰片段的沉默效率分别为62.9％±0.033，72.9％±0.102； PPARα干扰片段的沉默效率分别为40.28％±0.0123，55.29％±0.02486。 （3）PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞株KLE及HEC-1a生长抑制作用呈时间依赖性。转染后24小时，细胞生长抑制作用与对照组相比无明显差异。转染后48小时，出现有统计学意义的差别；72小时后，细胞生长出现明显的抑制。 （4）PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞株KLE及HEC-1a细胞凋亡的影响PPARγ干扰质粒转染细胞在60小时已出现早期核凋亡改变，核膜皱缩，成波浪状，染色体凝集成块状。72小时，凋亡细胞明显增多，KLE细胞干扰组与对照组相比，差别有统计学意义；HEC-1-A：干扰组与阴性对照组相比，差别有统计学意义。而空白对照组与阴性对照组相比，差别无统计学意义。 （5）Transwell体外侵袭实验检测PPARγ干扰质粒对子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1a细胞株侵袭力的降低。KLE、HEC-1-A细胞转染48小时与空白对照组及阴性对照组相比，干扰组的侵袭率明显减少，KLE细胞：X2=93.32，v=1，P<0.05； HEC-1a细胞：X2=1.834，v=1，P<0.05，差异有统计学意义。 （6）PPARα干扰质粒转染KLE及HEC-1a细胞株后，生长抑制作用不明显。转染后72小时，对空白对照组、阴性对照组及干扰组的吸光度行方差分析， KLE细胞：F=2.198，P=0.123，P>0.05，差别无统计学意义，而HEC-1a细胞对PPARα干扰质粒的反应同样无明显差异。 （7）PPARα干扰质粒转染稳筛后的KLE细胞株时，干扰组与空白对照组及阴性对照组相比差别有统计学意义。而PPARα干扰质粒转染稳筛的HEC-1a细胞株时，干扰组与对照组相比差别有统计学意义。 （8）转染PPARα干扰质粒后72小时，稳筛的KLE及HEC-1a的干扰组细胞出现凋亡现象。稳筛的KLE：干扰组与阴性对照组相比，差别有统计学意义；稳筛的HEC-1a：干扰组与阴性对照组相比，差别有统计学意义； 结论: 1.PPARγ的下调能够抑制子宫内膜癌细胞株KLE及HEC-1a的生长，此抑制作用呈时间依赖性。 2.PPARγ下调能够诱导子宫内膜癌细胞株KLE及HEC-1a的凋亡 3.PPARγ的下调能够抑制子宫内膜癌细胞株KLE及HEC-1a侵袭的发生。 4.下调PPARα的表达，并没有抑制肿瘤细胞生长或诱导凋亡，可能与选择的干扰片断效能有关，但同时下调PPARγ后，生长抑制作用明显，说明PPARα及PPARγ在调节肿瘤生物学行为方面起协同作用。