随着人类平均寿命的增长和生活水平的提高，心血管疾病的发病率一直居高不下，也是全球范围内人类的第一死因。心肌纤维化是多种心血管疾病（如心肌梗死、高血压等）不断进展最终导致心脏功能衰竭的一个重要病理改变，它是心肌重构的关键病理特征和重要形成原因。其主要表现为心肌组织中胶原纤维过度沉积，胶原含量显著增加，各型胶原比例失调（Ⅰ/Ⅲ型比例增加）且排列紊乱。心肌纤维化的发病机制与多种因素相关，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统、内皮衍生因子、儿茶酚胺、生长因子、组织因子、趋化因子及ROS等。因此，抑制心肌纤维化的发生发展是治疗心血管疾病的重要环节，对降低心血管疾病的致死风险具有重要意义。真核细胞通过激活细胞信号转导机制对外部刺激（如生长因子、细胞因子、物理或化学应力等）作出反应，其中介导刺激信号从细胞膜传递到细胞核或其它胞内靶点的一个主要系统就是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProtein Kinase, MAPK）超级家族。MAPK参与调节多种细胞进程，如细胞生长、分化、细胞周期及细胞凋亡等。ERK、SAPK/JNK及p38MAPK是心肌组织中三个主要的MAPK级联信号转导途径。MAPK通路在多种心血管疾病的进展中发挥着重要的调控作用，是心血管系统药理研究的一个热门靶点。本课题组近年来一直从事罗布麻提取物对心血管系统保护作用的研究，已证实其可抑制心肌纤维化的进展，机制可能与ERK信号级联有关。槲皮素、芦丁是罗布麻的主要有效成分，芦丁为槲皮素的一种糖苷衍生物。槲皮素和芦丁已被证实具有抗肿瘤、保护心脑血管等多种生物学活性，但其在抑制心肌纤维化方面作用的系统研究尚未见文献报道。以提纯的槲皮素和芦丁作为物质基础，通过体内和体外实验，系统地研究其抗心肌纤维化的作用及机制，是对罗布麻提取物抗心肌纤维化作用研究的必要补充和合理延伸，将为进一步研发以罗布麻为基础的抗心肌纤维化药物提供理论依据。在体内实验中，沿用本实验室改良的大鼠心肌纤维化模型，即一次性大剂量皮下多点注射ISO复制大鼠心肌纤维化模型，灌胃给予槲皮素、芦丁3周后，检测大鼠心功能、血清心肌酶和抗氧化酶、血浆AngⅡ和ALD，以及心肌组织中TGF-β1、CTGF和胶原蛋白的表达情况，并检测了心肌组织中MAPK的磷酸化水平。实验结果表明，与正常对照组相比，ISO模型组大鼠左心室收缩压及左心室发展压最大变化速率降低、左心室舒张末压升高，心功能出现明显损伤；心重指数明显升高；血清中CK、CKMB、LDH、GOT及MDA含量显著增加，SOD活性显著降低；血浆中AngⅡ和ALD水平明显升高。HE染色发现心肌组织出现明显的纤维化改变，同时免疫组织化学结果显示心肌组织中胶原含量明显增加。这些与文献报道的心肌纤维化特征一致，证明心肌纤维化模型复制成功。同时，ISO模型组大鼠心肌组织中TGF-β1及CTGF的表达量显著增加，ERK、p38及JNK的磷酸化水平明显升高。灌胃给予槲皮素、芦丁3周后，可以升高左心室收缩压及左心室发展压最大变化速率，降低左心室舒张末压，显著改善心功能。与ISO相比，槲皮素、芦丁给药组大鼠的心重指数出现降低，血清中CK、CKMB、LDH、GOT及MDA含量明显减少，SOD活性显著增加，血浆中AngⅡ和ALD水平降低。同时，槲皮素、芦丁可以下调大鼠心肌组织中TGF-β1及CTGF的表达量，降低ERK、p38及JNK的磷酸化水平。心肌组织HE染色和免疫组化的结果也表明，槲皮素、芦丁能够明显改善心肌的组织形态，减少胶原的沉积，逆转心肌纤维化。以上结果表明，槲皮素、芦丁可以保护心功能，减少ECM沉积，抑制ISO诱导的心肌纤维化。此外，我们对比槲皮素与芦丁对上述实验指标的作用发现，在含有相同槲皮素苷元剂量的情况下，槲皮素对心肌纤维化的抑制作用明显优于芦丁。体外实验我们采用AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖模型，首先通过检测心肌成纤维细胞的DNA合成、胶原分泌、TGF-β1及CTGF的表达，研究了槲皮素、芦丁对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖的影响。我们的实验结果显示，AngⅡ刺激乳鼠心肌成纤维细胞，可显著增加细胞的DNA合成，增加ColⅠ及ColⅢ的分泌，上调TGF-β1及CTGF的表达，此结果与文献叙述一致。槲皮素、芦丁预给药能够显著减少心肌成纤维细胞的DNA合成，抑制ColⅠ及ColⅢ的分泌，下调TGF-β1及CTGF的表达，表明槲皮素、芦丁可以抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖。此外，通过体外试验我们还发现，槲皮素对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的抑制作用明显优于相同摩尔浓度的芦丁，此结果表明，芦丁结构中的芸香糖基可能影响了其跨膜转运效率，或影响了其与相关作用靶点的亲和性，从而导致其药理活性的下降。为确定ROS是否介导心肌纤维化过程，我们研究了ROS的清除剂NAC对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用。实验结果显示，给予NAC可以显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞DNA合成，减少ColⅠ及ColⅢ的分泌，下调TGF-β1及CTGF的表达，表明ROS介导AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖过程。为确定槲皮素是否通过ROS途径抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖，我们检测了槲皮素预给药对AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞内H2O2含量的影响，实验结果显示，AngⅡ刺激组细胞内H2O2含量相较于正常对照组出现明显增加，槲皮素预给药可以显著抑制细胞内H2O2的产生。上述实验结果表明，槲皮素可以通过ROS途径抑制心肌纤维化。为确定MAPK信号通路是否介导心肌纤维化，我们研究了ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB202190及JNK抑制剂SP600125对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用。实验结果显示，PD98059、SB202190及SP600125均能明显抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞DNA合成，减少ColⅠ及ColⅢ的分泌，下调TGF-β1及CTGF的表达，表明MAPK信号通路介导AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖过程。进一步细胞实验结果显示，给予NAC、QUE均可以抑制AngⅡ诱导的ERK、p38及JNK的磷酸化，表明ROS介导AngⅡ诱导的MAPK信号通路活化，我们的前述实验结果已证实槲皮素可以抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞内H2O2的产生，因此槲皮素可能是通过抑制ROS介导的MAPK信号通路激活，从而改善AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖。为进一步确定槲皮素是否通过ROS途径影响MAPK信号通路，本实验采用外源性H2O2刺激心肌成纤维细胞，Western Blotting检测槲皮素对ERK、p38及JNK磷酸化的影响。实验结果显示，外源性H2O2刺激可以增加ERK、p38及JNK的磷酸化，刺激前给予槲皮素可以显著降低外源性H2O2诱导的ERK、p38及JNK的磷酸化，表明槲皮素可以抑制ROS诱导的MAPK信号通路活化。综上所述，槲皮素及其糖苷衍生物芦丁可以抑制ISO诱导的心肌纤维化，并且槲皮素对心肌纤维化的抑制作用优于芦丁。其抗心肌纤维化的机制可能与抑制ROS介导的MAPK信号通路有关。