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我国在上世纪七十年代,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所沈荣显教授领导的科研小组,通过体外传代的方法,研制成功了世界上第一个也是唯一的慢病毒疫苗——马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗(DLV)和驴胎皮肤细胞弱毒疫苗(FDDV),并申请了专利保护。该疫苗对同源和异源强毒均有较好的免疫力,成功控制了该病在我国的流行。DLV临床使用将近30年,安全性得到了充分的验证,为研究其他逆转录病毒疫苗提供了良好的自然动物模型体系。EIAV弱毒疫苗研制成功对HIV疫苗的研制有重要的指导意义,因此阐明中国EIAV强毒株和疫苗株的毒力特征、免疫保护机制和基因变异特点也显得尤为重要。
为了从分子水平阐明中国EIAV弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机制,本实验室前期工作首先对EIAV疫苗研制过程中的四个经典毒株进行序列分析,即强毒株LN、D510和疫苗株DLV、FDDV。根据存在于强毒株和疫苗株之间的一致性稳定突变位点,在FDDV的低拷贝全长感染性分子克隆pLGFD3的基础上先后构建了env基因内4个点和6个点回复突变为强毒特征的感染性分子克隆mFD5-4-7和mFD7-2-11,并获得了相应的衍生病毒。本研究涉及的毒种包括上述强毒LN,疫苗毒DLV,疫苗毒pLGFD3和env逆向回复突变毒mFD5-4-7和mFD7-2-11,对其在体内的病毒学、免疫学和序列变化进行综合分析,以阐明强毒与疫苗毒之间的本质差异,并着重探讨env区涉及的一致性突变位点对毒力及免疫的影响。
本研究首先建立了实时定量RT-PCR检测血浆EIAV RNA病毒载量的方法并进行了方法学评价,以对EIAV在动物体内的复制情况进行直观的量化分析。对EIAV强毒株LN,驴白细胞弱毒疫苗株DLV,驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株pLGFD3,和env逆向回复突变株mFD5-4-7和mFD7-2-11接种动物定期或发热期采集的血浆样品进行检测,结合动物的临床体温和血小板检测结果,对EIAV各毒株在动物体内的复制特点及毒力特征进行分析和评价。为了评价EIAV弱毒疫苗的免疫保护机制,本研究对DLV、pLGFD3、mFD5-4-7和mFD7-2-11接种动物进行了体液免疫(包括结合抗体p26和中和抗体)和细胞免疫(包括淋巴细胞增殖功能和细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能)的动态跟踪检测。EIAV基因组在体内有较高的变异率,从而可能影响到病毒的毒力和免疫,本研究对强毒LN接种马在各个发热点的血浆RNA进行巢式RT-PCR扩增env gp90片段,扩增产物克隆后进行测序分析。对pLGFD3、mFD5-4-7和mFD7-2-11接种动物,主要针对体外操作发生点突变的区域进行测序分析。本研究结果中有关中国EIAV强弱毒株的毒力特点、免疫特点和序列特征信息有助于我们进一步了解我国EIAV弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机制,为包括HIV在内的其他慢病毒疫苗的研制提供思路。