吸入含有游离性二氧化硅的粉尘可以导致矽肺，它以肺部慢性炎症和纤维化为主要病理改变[1]。游离二氧化硅在自然界中分布极广，它是许多岩石和矿石的组成成分，因此接触二氧化硅的作业也是分布广泛的。虽然我国在控制游离性二氧化硅粉尘的产生和扩散、降低作业场所二氧化硅粉尘浓度、改善劳动环境方面做了大量工作，而且已取得了一定的成绩，但其危害的形势依然严峻。因此，进行二氧化硅所诱导炎症的研究对矽肺的预防和治疗具有重要的指导意义。　　 二氧化硅颗粒进入肺组织后，首先接触的是肺泡巨噬细胞。它可以通过细胞表面所表达的受体MARCO识别并吞噬游离性二氧化硅粉尘。经过二氧化硅刺激的巨噬细胞一方面释放前炎性因子IL-1β，TNF-a等，另一方面作为抗原提呈细胞调节T淋巴细胞反应，促进T淋巴细胞释放IL-4，IL-13，IFN-γ等效应因子。动物实验证明，在SiO2诱导的肺部炎症和免疫反应中发挥主要作用的辅助性T细胞是CD4+T细胞。CD4+T细胞可以分化为Th1，Th2，Treg和Th17细胞。炎症早期的效应T淋巴细胞主要是Th1型细胞，随着疾病发展进入纤维化反应期后，效应T淋巴细胞发生Th2型细胞极化。而Th1和Th2型免疫反应之间存在抑制平衡的现象，这种平衡受到Treg细胞的调控。Th17细胞是新近发现的一种细胞类型，分泌IL-17A、IL-17F，IL-21、IL-22等细胞因子，并特异性表达转录因子ROR-γt。Th17细胞在实验性矽肺的早期炎症阶段发挥促炎作用，其分化受到细胞因子TGF-β，IL-6，IL-1β和/或IL-23的调节。IL-17A是Th17细胞的主要效应因子，能诱导IL-1β，IL-6等细胞因子的分泌，起到促进炎症发展的作用。IL-17A的抗体(anti-IL-17A mAb)能中和掉IL-17A达到抑制其功能的作用，除此之外，阻滞Th17分化过程中的关键因子也能削弱IL-17A的功能。IL-1Ra(Anakinra)能与IL-1β竞争结合IL-1受体，而不启动胞内信号转导通路激活细胞，从而抑制IL-1β的生物学作用。IL-1β能促进Th17的分化。因此，IL-1受体阻滞剂和IL-17A抗体都能影响IL-17A的分泌和功能。　　 当肺巨噬细胞和脾淋巴细胞从体内提取出来，建立体外培养体系并给与不同的处理因素后，Th1，Th2，Treg，Th17及其相关细胞因子的分泌和表达情况是如何变化的？IL-17A对Th1/Th2免疫应答以及Th17与Treg之间的平衡的影响如何？IL-17A水平的降低对Th17细胞的分化有何作用？为回答上述问题，我们拟利用C57BL/6小鼠获取肺泡巨噬细胞和脾淋巴细胞，建立体外培养体系，并体外给予PBS，SiO2，SiO2加IL-1受体阻滞剂和SiO2加IL-17A抗体的不同处理。然后在不同时间点获得上清液和两种细胞，检测各种细胞因子的分泌和表达情况。以期能为探明矽肺发病免疫学机制提供新的实验依据。　　 实验方法：　　 一、动物和细胞的准备　　 C57BL/6小鼠（6-8周龄，雌性）适应性喂养一周后，腹腔注射苯巴比妥钠麻醉后，用非暴露方式进行气管的PBS灌注，每只小鼠灌注80μlPBS，目的是刺激肺部产生更多的巨噬细胞。　　 二、获取小鼠巨噬细胞　　 经PBS灌注的C57BL/6小鼠于第3天处死，采用颈椎脱位法。取小鼠仰卧位，自下腹部剪开胸腔，游离肺脏及气管。用14号针头插入气管腔内，并用缝线固定，行气管肺泡灌洗，将1ml PBS缓慢注入肺内，间隔30秒后，将其抽回，收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagenuld，BALF)，多次回收，总共得到大约6ml灌洗液。1500 rpm离心8分钟。收集细胞，取少量进行细胞计数，剩余细胞用培养基将细胞的终浓度调至2×105，备用。　　 三、获取小鼠淋巴细胞　　 小鼠处死后，将胸部及腹部皮肤酒精消毒后，取右侧卧位，剪开下腹部皮肤及肌肉组织，取出脾脏，用PBS冲洗几遍，转移到高压过的35 mm平皿中，加入4-5ml淋巴细胞分离液，200目不锈钢网上研磨，小心收集洗液，切勿颠倒。收集到15ml离心管中，液体表面小心滴加200-500μl混合培养基。2000rpm离心30分钟，离心后收集淋巴细胞层的细胞到新的离心管，然后用混合培养基清洗一遍后计数细胞，调整细胞浓度至1×107，备用。　　 四、体外共培养体系的建立　　 将巨噬细胞分为4组:对照组，二氧化硅组，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组。每组有2毫升的巨噬细胞悬液，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的巨噬细胞分别给予30μgIL-1受体阻滞剂或40μgIL-17A抗体的处理，并360度翻转培养15分钟。其他两组给予PBS的平行对照处理。翻转培养15分钟后，在对照组加入16μl PBS，其他三组分别加入16μl SiO2悬浮液（5mg/ml）。四个组的巨噬细胞继续翻转培养45分钟，然后移入12-孔细胞培养板中，37℃和5％ CO2条件下培养2小时，并允许其贴壁。淋巴细胞也分为4个组:对照组，二氧化硅组，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组。每组有2毫升的淋巴细胞悬液，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的淋巴细胞分别给予60μg IL-1受体阻滞剂或80μg IL-17A抗体的处理，37℃和5％ CO2条件下培养30分钟。其他两组给予PBS的平行处理。巨噬细胞培养2小时后，小心地吸取上清弃掉，然后将预处理过的淋巴细胞一一对应地加入巨噬细胞的培养孔中进行共培养。最终保证每组有2(×)105个巨噬细胞和1(×)107个淋巴细胞。四个组的处理条件分别为:PBS，SiO2(40μg)，SiO2(40μg)加IL-1受体阻滞剂（15μg/ml）和SiO2(40μg)加IL-17A抗体（20μg/ml）。培养条件为37℃和5％CO2。　　 在共培养24小时和48小时后，将培养孔中的培养液和细胞吸出到1.5ml EP管中，1500r/min，4℃，离心8min，上清液置入新管留做ELISA，下层细胞层加入Trizol防止RNA降解留做realtime RT-PCR。放入-70℃保存。　　 五、EL I SA方法检测细胞因子的分泌水平　　 在ELISA试剂板中每孔加入100μl包被抗体，冰箱4℃过夜。次日，弃液洗涤。每孔加200μl检测缓冲液室温孵育1h。加一定稀释的待检样品及标准品100μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育2小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。于各反应孔中，加入100μl检测抗体室温孵育1h，洗涤。室温加入100μl酶孵育30 min。不洗涤直接加入100μl底物显色15分钟左右。于各反应孔中加入50μl反应终止液。可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。每个样品设3个平行孔。ELISA方法检测培养液上清中Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，Th2型细胞因子IL-4，Th17型细胞因子IL-17A，抑制性细胞因子IL-10和TGF-β，以及Th17细胞分化相关细胞因子IL-6，IL-23，IL-1β的分泌水平。　　 六、Real-time PCR方法检测转录因子的表达水平　　 在淋巴细胞层加入1ml Trizol试剂，冰浴匀浆，12000rpm离心10分钟，将上清转移至新管中，室温静置5分钟;每管加入200μl氯仿，用力震荡15秒，室温静置2-3分钟;4℃，12000rpm，离心15分钟;从每管中吸取上清至另一新的1.5mlEP管。加入等体积-20℃预冷的0.5ml异丙醇，混匀后室温沉淀10分钟;4℃，12000rpm离心10分钟后，弃上清;加入4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁;4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清;室温干燥5-10分钟;加入10μl Rnase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度并调整至1μg/μl。参照试剂盒操作说明书，将RNA反转录为cDNA，-20℃保存。PCR反应采用SYBR Green和Taqman两种方法，分别按照说评说在反应管中加入混合反应液，再加入适量样品。在ABI7500仪器上按下列条件进行反应:90℃30秒，之后每一步变性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共进行40个循环。SYBR Green方法用于检测T-bet，GATA-3，Foxp3，ROR-γt和IL-23的mRNA表达水平，TaqMan方法用于检测IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β1，IL-17A，IL-1beta，IL-6和GAPDH的mRNA表达水平。　　 七、统计学分析　　 全部数据采用SPSS19.0统计学软件进行分析，统计结果表示为均数±标准差。采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，当差异有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，p＜0.05具有统计学意义。　　 结果：　　 一、阻断IL-1信号通路或中和IL-17A有效降低IL-17A的分泌　　 ELISA和Realtime-PCR的方法用于检测巨噬-淋巴细胞共培养体系中IL-17A的分泌和mRNA表达水平。结果显示，二氧化硅组的IL-17A分泌和mRNA表达都高于对照组，差异有统计学意义。与二氧化硅组相比，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的IL-17A分泌水平都大幅下降，甚至比对照组更低，差异有统计学意义。IL-1受体阻滞剂组的IL-17A mRNA表达水平显著低于二氧化硅组，而IL-17A抗体组与二氧化硅组的IL-17AmRNA表达水平没有显著差异。　　 二、阻断IL-1信号通路或中和IL-17A可以抑制Th1反应　　 IFN-γ和IL-2是Th1细胞分泌的主要细胞因子。经二氧化硅刺激后，IFN-γ和IL-2的分泌和mRNA表达水平都显著升高。而与二氧化硅组相比，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的IFN-γ和IL-2的分泌和mRNA表达水平都显著降低。T-bet是Th1细胞的特异性转录因子。二氧化硅组比对照组表达更高水平的T-bet,而IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组表达的T-bet水平要低于二氧化硅组，差异在48小时有统计学意义。这表明在巨噬-淋巴细胞共培养体系中，阻断IL-1信号通路或中和IL-17A能抑制Th1反应。　　 三、阻断IL-1信号通路或中和IL-17A可以促进Th2反应　　 IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子。经二氧化硅刺激后，IL-4的分泌和mRNA表达水平都显著升高。与二氧化硅组相比，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的IL-4的分泌和mRNA表达水平都显著升高。GATA-3是Th2细胞的特异性转录因子。二氧化硅组比对照组表达更高水平的GATA-3。IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的T-bet表达水平高于二氧化硅组，差异在48小时有统计学意义。这表明在巨噬-淋巴细胞共培养体系中，阻断IL-1信号通路或中和IL-17A能促进Th2反应。　　 四、阻断IL-1信号通路或中和IL-17A可以增强Treg功能　　 二氧化硅组的IL-10分泌和mRNA表达水平显著高于对照组，而IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的IL-10分泌和mRNA表达水平比二氧化硅组更高，差异有统计学意义。然而各组之间TGF-β的水平没有显著差异。Foxp3是Treg细胞的特异性转录因子。与二氧化硅组相比，IL-1受体阻滞剂组和IL-17A抗体组的Foxp3表达水平在两个时间点都显著升高。这表明在巨噬-淋巴细胞共培养体系中，阻断IL-1信号通路或中和IL-17A能促进Treg反应。　　 五、阻断IL-1信号通路可以抑制IL-17A的表达，影响Th17细胞的分化　　 IL-1受体阻滞剂的应用显著降低了IL-17A的mRNA表达水平，这表明阻断IL-1信号通路可以抑制IL-17A的mRNA表达。IL-6，TGF-β，IL-1和IL-23是与Th17细胞分化密切相关的因子，它们的检测结果显示，培养48小时后，IL-1受体阻滞剂组IL-6分泌和mRNA表达水平显著低于二氧化硅组。TGF-β的水平没有显著改变。然而L-1受体阻滞剂的处理却显著上调了IL-1β和IL-23的分泌，其中只有IL-1受体阻滞剂组的IL-23 mRNA表达水平明显升高，并且两个时间点的差异都有统计学意义。这表明阻断IL-1信号通路可以影响Th17细胞的分化。　　 结论：　　 1.在巨噬-淋巴细胞的共培养体系中，Th17反应参与SiO2诱导的炎症。　　 2.降低IL-17A的分泌能促进Treg细胞的功能，进而影响SiO2诱导的Th免疫类型。　　 3.阻断IL-1信号通路能抑制IL-17A的分泌和mRNA表达，同时影响Th17细胞的分化。