【摘 要】
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双歧杆菌作为人体肠道内的主要菌群,可通过黏附定植肠上皮细胞,形成生物屏障,产生有机酸和降低环境中氧化还原电位等机制,阻止外源微生物特别是致病菌的侵入,从而发挥调节肠道微生态平衡,抗炎症和促进宿主健康等作用。 黏附和免疫是双歧杆菌发挥重要生理作用的基础,然而,有关双歧杆菌黏附肠上皮细胞的作用机制和参与免疫作用的物质基础仍不甚清楚,目前有关黏附和免疫的研究主要集中在双歧杆菌的外膜蛋白上。2006
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双歧杆菌作为人体肠道内的主要菌群,可通过黏附定植肠上皮细胞,形成生物屏障,产生有机酸和降低环境中氧化还原电位等机制,阻止外源微生物特别是致病菌的侵入,从而发挥调节肠道微生态平衡,抗炎症和促进宿主健康等作用。 黏附和免疫是双歧杆菌发挥重要生理作用的基础,然而,有关双歧杆菌黏附肠上皮细胞的作用机制和参与免疫作用的物质基础仍不甚清楚,目前有关黏附和免疫的研究主要集中在双歧杆菌的外膜蛋白上。2006年瑞士雀巢公司研究发现长双歧杆菌的细胞表面存在丝氨酸蛋白酶抑制剂-Serpin （serine protease inhibitor）,由350至500个氨基酸组成,起着保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化等作用。近四年原核生物的Serpin研究引起了关注,然而双歧杆菌中Serpin的研究报道甚少。 本研究通过两种方法来筛选Serpin蛋白。（1）根据plasminogen （Plg）且有Serpin底物结构域一丝氨酸蛋白酶结构域的特点,本研究采用磁珠法偶联μplg蛋白与双歧杆菌共孵育,捕获Serpin或类Serpin蛋白,结果显示μplg蛋白捕获到外膜蛋白中一个60 kD的蛋白；（2）由于serpin基因的同源保守性较差,通过保守序列引物扩增的方法很难达到分离serpin的目的。为此,本研究通过制备Serpin多克隆抗体,利用免疫学斑点杂交方法筛选产Serpin或类Serpin蛋白的双歧杆菌,初步筛选到婴儿双歧杆菌WBAN07中产Serpin蛋白。 此外,本研究构建了serpin插入失活载体,试图利用自身同源重组将B.longum WBL001中的serpin基因失活,得到serpin基因的缺失突变株,为后续serpin的功能研究奠定了基础。 综上所述,本文为筛选益生菌功能蛋白提供了方法学参考,为研究其黏附机制开辟了新的途径。
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