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背景和目的
2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已经成为全球流行的慢性疾病，其并发症包括糖尿病酮症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性周围神经病变等。随着糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率逐渐增高，其引起的认知功能障碍逐渐引起重视。糖尿病性认知功能障碍(diabetic associated cognitive decline, DACD )以获得性认知行为缺陷为特征，学习、记忆以及复杂信息处理能力下降，认知功能损伤的程度不一，多为轻到中度，但会明显影响日常生活，降低生活质量，因此学者提出了“DACD”的概念。研究已经证实DM明显增加痴呆及认知障碍风险，在不同年龄T2DM患者中均发现记忆、信息处理速度、注意力及执行功能等下降。
近年来研究发现大脑白质病变(white matter lesions, WML)可能在DACD中起一定作用。不同灰质区域间的信息传递依赖于完整健康的脑白质(white matter, WM)，一旦白质结构完整性破坏即可能出现信息传递障碍从而引起认知功能下降。T2DM患者多表现为广泛的WML，且较非DM患者更早出现WML，WML很可能在DACD发病过程中起重要作用。研究发现执行功能与外囊左前肢及左侧内囊WM完整性明显相关。WM纤维网络的中断也与T2DM患者信息处理速度减慢相关。然而，DACD发生发展与WML的相关性及机制仍不明确，且在DM的不同阶段WML对认知损伤的影响程度也不清楚。
为探讨在T2DM患者和T2DM大鼠中WML与DACD的相关性及WML导致DACD的机制，本研究拟首先分析在T2DM患者中WML与DACD的相关性。由于混杂因素较多，进一步建立T2DM大鼠模型，在动物模型中探讨T2DM发生发展与WML的关系及WML与DACD的关联性。最后利用蛋白质非标记定量技术(Label-free)对T2DM组和健康对照组大鼠脑白质的差异蛋白质进行分析，进而筛选出可能与DACD相关的脑白质内差异蛋白质，经过对差异蛋白进行生物信息学分析后，最后选取一些差异蛋白质进行表达量验证，提高实验结果的可信度。以期为改善和预防DACD提供新的诊疗策略。
第一部分2型糖尿病患者脑白质病变与糖尿病性认知功能障碍相关性分析
材料与方法
1.分析519例住院T2DM患者。根据头颅磁共振(magnetic resonance image, MRI)检查，有脑白质高信号(white matter hyperintensity, WMH)改变诊断为WML，据此分为无WML组(non-WML组,n=139)和WML组(WML组,n=380)。使用蒙特利尔认知量表(MoCA)对入组患者进行认知测评。比较两组间认知功能障碍患病率差异，分析WML发病的主要危险因素、认知功能障碍发病的危险因素以及两者之间的相关性。
2.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验；相关危险因素分析采用二元logistic回归；相关性分析采用Spearman相关性分析法；检验水准为α=0.05。
结果
1.两组间一般资料比较显示：WML组糖尿病病程、高血压患病率明显高于non-WML组(P<0.05)，总胆固醇(total cholesterol, TC)水平明显低于non-WML组(P<0.05)。
2.WML相关危险因素分析：年龄、糖尿病病程、是否患高血压以及糖化血红蛋白(hglycosylated hemoglobin, HbA1c)为WML的危险因素(β值分别为0.146、0.110、3.532、0.448)。
3.认知功能障碍危险因素及相关性分析：WML组认知障碍患者比例明显高于non-WML组(P<0.05)。WML患者主要表现为视空间、执行功能、注意力及计算力、延迟回忆功能等下降。是否合并WML、年龄及体重指数(body mass index, BMI)为认知功能障碍的主要危险因素(β值分别为0.759、0.161、0.221)。Spearman相关分析显示是否患WML与MoCA评分明显相关(r=0.738,P=0.001)。
第二部分2型糖尿病大鼠脑白质病变与糖尿病性认知功能障碍相关性分析
材料和方法
1.选取60只SD大鼠，适应性喂养1周后随机分为4组：正常对照组(NC )，二甲双胍对照组(NC+MET)，T2DM组及T2DM+二甲双胍组(T2DM+MET)。分组喂养：T2DM组及T2DM+MET组大鼠喂养高脂高糖饲料，NC组及NC+MET组大鼠喂养普通饲料。分组喂养8周后，T2DM组及T2DM+MET组大鼠腹腔注射链脲霉素构建T2DM模型。
2.各组大鼠分别在分组喂养前、分组喂养8周后及腹腔注射链脲霉素8周后使用Morris水迷宫评价各组大鼠三个不同时期内认知功能，每次水迷宫检查结束后使用磁共振弥散张量成像技术(diffusion tensor imaging scans, DTI)测量各组大鼠双侧丘脑区各向异性分数(fractional anisotropy, FA)值评价大鼠脑白质病变程度。第三次DTI结束后处死大鼠，使用免疫荧光技术定量检测大鼠脑白质中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、少突胶质细胞转录因子-1(oligodendrocyte transcription factor 1, OLIG1 )及少突胶质细胞转录因子-2(oligodendrocyte transcription factor 2, OLIG2)表达量，再次从蛋白水平评价大鼠脑白质病变程度。
3.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件。使用Shapiro-Wilk检验来评估连续数据的正态性，正态分布数据用均值±标准差(-x±s)表示，使用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较；非正态分布数据用中位数(P50)和四分位数间距(P25 ， P75 )表示，并用Kruskal-Wallis检验进行组间比较；采用Pearson和Spearman相关分析法进行相关分析。检验水准为α=0.05。
结果
1.分组喂养前组间比较：分组喂养前各组大鼠的逃避潜伏期和穿越平台次数无明显差异(P>0.05)，双侧丘脑区FA值无明显差异(P>0.05)。
2.分组喂养8周后组间比较：分组喂养8周后，T2DM组及T2DM+MET组大鼠出现空腹血糖受损，未达到DM诊断标准。各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数均无明显差异(P>0.05)，但T2DM组及T2DM+MET组大鼠右侧丘脑区域FA值明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。
3.腹腔注射链脲霉素8周后组间比较：腹腔注射链脲霉素3天后T2DM组及T2DM+MET组大鼠血糖均达到DM诊断标准，建模成功。继续喂养8周后，水迷宫结果显示T2DM组及T2DM+MET组大鼠逃避潜伏期明显长于NC组及NC+MET组(P＜0.05)，而穿越平台次数则明显少于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。DTI结果显示T2DM组大鼠双侧丘脑区及T2DM+MET组大鼠左侧丘脑区FA值均明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。同时，T2DM+MET组大鼠右侧丘脑区FA值明显高于T2DM组(P＜0.05)。
4.T2DM大鼠WML与认知功能障碍相关性分析：T2DM组大鼠逃避潜伏期长短与右侧丘脑区FA值明显相关(r=0.996,P=0.001)，大鼠穿越平台次数与右侧丘脑区FA值明显相关(r=0.831,P=0.001)。
5.免疫荧光结果显示：T2DM组及T2DM+MET组大鼠MBP表达量明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)，而OLIG1、OLIG2表达量则明显高于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。
第三部分2型糖尿病大鼠脑白质差异蛋白质组学分析
材料与方法
1.本研究选取20只SD大鼠随机分为两组：对照组大鼠(Control组，10只)和T2DM大鼠模型组(T2DM组，10只)，两组大鼠分组喂养并利用高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲霉素建立T2DM模型(同第二部分)。
2.使用蛋白质非标记定量技术(Label-free)进行Control组和T2DM组脑白质差异蛋白质组学分析。筛选出可能与T2DM合并的WML发病相关的差异蛋白质，经生物信息学分析后，选取一些差异蛋白质进行Westernblot表达量验证。
3.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件，所有计量资料样本均数的离散趋势均用均值±标准差(-x±s)表示。两组间比较采用两独立样本均数的t检验，检验水准为α=0.05。不同样品组之间差异蛋白的筛选标准：FC＜-2.0或FC＞2.0且P＜0.05，视为差异蛋白。
结果
1.Control组和T2DM组大鼠脑白质蛋白经比较，共筛选到38种差异蛋白：24个蛋白表达上调，14个蛋白表达下调。
2.差异蛋白质主要分布在细胞膜、细胞质、外泌体和神经突触等，大多数是具有分子结合活性的蛋白，主要参与神经系统发育、对药物的反应、缺氧反应、负向调控神经细胞的凋亡以及化学突触传递等生物学过程。
3.差异蛋白主要具有EF-hand样结构域、EF-hand结构域、PDZ结构域、免疫球蛋白亚型2结构域和S100类钙结合蛋白结构域等。差异蛋白主要富集在4个KEGGpathway信号通路上。
4.差异蛋白以BDNF、NOS1、GAP43、SLC17A7、DNM1、GRM5和SLC1A2等蛋白为核心骨架，形成蛋白相互作用信息网络。
5.Westernblot验证，蛋白表达水平与蛋白质组学实验结果一致。
结论
1.在T2DM患者中WML与DACD明显相关。
2.WML在糖尿病前期及DACD发生前已经出现，随着WML加重DACD逐渐出现。在大鼠模型中右侧丘脑区WML与DACD明显相关。二甲双胍可能有减轻WML作用但是对DACD无明显影响。
3.利用Label-free技术能够有效的筛选出与T2DM大鼠WML相关的差异蛋白质，差异蛋白可能与神经突触传递或者神经系统细胞信号转导调控有关。
2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已经成为全球流行的慢性疾病，其并发症包括糖尿病酮症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性周围神经病变等。随着糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率逐渐增高，其引起的认知功能障碍逐渐引起重视。糖尿病性认知功能障碍(diabetic associated cognitive decline, DACD )以获得性认知行为缺陷为特征，学习、记忆以及复杂信息处理能力下降，认知功能损伤的程度不一，多为轻到中度，但会明显影响日常生活，降低生活质量，因此学者提出了“DACD”的概念。研究已经证实DM明显增加痴呆及认知障碍风险，在不同年龄T2DM患者中均发现记忆、信息处理速度、注意力及执行功能等下降。
近年来研究发现大脑白质病变(white matter lesions, WML)可能在DACD中起一定作用。不同灰质区域间的信息传递依赖于完整健康的脑白质(white matter, WM)，一旦白质结构完整性破坏即可能出现信息传递障碍从而引起认知功能下降。T2DM患者多表现为广泛的WML，且较非DM患者更早出现WML，WML很可能在DACD发病过程中起重要作用。研究发现执行功能与外囊左前肢及左侧内囊WM完整性明显相关。WM纤维网络的中断也与T2DM患者信息处理速度减慢相关。然而，DACD发生发展与WML的相关性及机制仍不明确，且在DM的不同阶段WML对认知损伤的影响程度也不清楚。
为探讨在T2DM患者和T2DM大鼠中WML与DACD的相关性及WML导致DACD的机制，本研究拟首先分析在T2DM患者中WML与DACD的相关性。由于混杂因素较多，进一步建立T2DM大鼠模型，在动物模型中探讨T2DM发生发展与WML的关系及WML与DACD的关联性。最后利用蛋白质非标记定量技术(Label-free)对T2DM组和健康对照组大鼠脑白质的差异蛋白质进行分析，进而筛选出可能与DACD相关的脑白质内差异蛋白质，经过对差异蛋白进行生物信息学分析后，最后选取一些差异蛋白质进行表达量验证，提高实验结果的可信度。以期为改善和预防DACD提供新的诊疗策略。
第一部分2型糖尿病患者脑白质病变与糖尿病性认知功能障碍相关性分析
材料与方法
1.分析519例住院T2DM患者。根据头颅磁共振(magnetic resonance image, MRI)检查，有脑白质高信号(white matter hyperintensity, WMH)改变诊断为WML，据此分为无WML组(non-WML组,n=139)和WML组(WML组,n=380)。使用蒙特利尔认知量表(MoCA)对入组患者进行认知测评。比较两组间认知功能障碍患病率差异，分析WML发病的主要危险因素、认知功能障碍发病的危险因素以及两者之间的相关性。
2.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验；相关危险因素分析采用二元logistic回归；相关性分析采用Spearman相关性分析法；检验水准为α=0.05。
结果
1.两组间一般资料比较显示：WML组糖尿病病程、高血压患病率明显高于non-WML组(P<0.05)，总胆固醇(total cholesterol, TC)水平明显低于non-WML组(P<0.05)。
2.WML相关危险因素分析：年龄、糖尿病病程、是否患高血压以及糖化血红蛋白(hglycosylated hemoglobin, HbA1c)为WML的危险因素(β值分别为0.146、0.110、3.532、0.448)。
3.认知功能障碍危险因素及相关性分析：WML组认知障碍患者比例明显高于non-WML组(P<0.05)。WML患者主要表现为视空间、执行功能、注意力及计算力、延迟回忆功能等下降。是否合并WML、年龄及体重指数(body mass index, BMI)为认知功能障碍的主要危险因素(β值分别为0.759、0.161、0.221)。Spearman相关分析显示是否患WML与MoCA评分明显相关(r=0.738,P=0.001)。
第二部分2型糖尿病大鼠脑白质病变与糖尿病性认知功能障碍相关性分析
材料和方法
1.选取60只SD大鼠，适应性喂养1周后随机分为4组：正常对照组(NC )，二甲双胍对照组(NC+MET)，T2DM组及T2DM+二甲双胍组(T2DM+MET)。分组喂养：T2DM组及T2DM+MET组大鼠喂养高脂高糖饲料，NC组及NC+MET组大鼠喂养普通饲料。分组喂养8周后，T2DM组及T2DM+MET组大鼠腹腔注射链脲霉素构建T2DM模型。
2.各组大鼠分别在分组喂养前、分组喂养8周后及腹腔注射链脲霉素8周后使用Morris水迷宫评价各组大鼠三个不同时期内认知功能，每次水迷宫检查结束后使用磁共振弥散张量成像技术(diffusion tensor imaging scans, DTI)测量各组大鼠双侧丘脑区各向异性分数(fractional anisotropy, FA)值评价大鼠脑白质病变程度。第三次DTI结束后处死大鼠，使用免疫荧光技术定量检测大鼠脑白质中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、少突胶质细胞转录因子-1(oligodendrocyte transcription factor 1, OLIG1 )及少突胶质细胞转录因子-2(oligodendrocyte transcription factor 2, OLIG2)表达量，再次从蛋白水平评价大鼠脑白质病变程度。
3.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件。使用Shapiro-Wilk检验来评估连续数据的正态性，正态分布数据用均值±标准差(-x±s)表示，使用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较；非正态分布数据用中位数(P50)和四分位数间距(P25 ， P75 )表示，并用Kruskal-Wallis检验进行组间比较；采用Pearson和Spearman相关分析法进行相关分析。检验水准为α=0.05。
结果
1.分组喂养前组间比较：分组喂养前各组大鼠的逃避潜伏期和穿越平台次数无明显差异(P>0.05)，双侧丘脑区FA值无明显差异(P>0.05)。
2.分组喂养8周后组间比较：分组喂养8周后，T2DM组及T2DM+MET组大鼠出现空腹血糖受损，未达到DM诊断标准。各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数均无明显差异(P>0.05)，但T2DM组及T2DM+MET组大鼠右侧丘脑区域FA值明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。
3.腹腔注射链脲霉素8周后组间比较：腹腔注射链脲霉素3天后T2DM组及T2DM+MET组大鼠血糖均达到DM诊断标准，建模成功。继续喂养8周后，水迷宫结果显示T2DM组及T2DM+MET组大鼠逃避潜伏期明显长于NC组及NC+MET组(P＜0.05)，而穿越平台次数则明显少于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。DTI结果显示T2DM组大鼠双侧丘脑区及T2DM+MET组大鼠左侧丘脑区FA值均明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。同时，T2DM+MET组大鼠右侧丘脑区FA值明显高于T2DM组(P＜0.05)。
4.T2DM大鼠WML与认知功能障碍相关性分析：T2DM组大鼠逃避潜伏期长短与右侧丘脑区FA值明显相关(r=0.996,P=0.001)，大鼠穿越平台次数与右侧丘脑区FA值明显相关(r=0.831,P=0.001)。
5.免疫荧光结果显示：T2DM组及T2DM+MET组大鼠MBP表达量明显低于NC组及NC+MET组(P＜0.05)，而OLIG1、OLIG2表达量则明显高于NC组及NC+MET组(P＜0.05)。
第三部分2型糖尿病大鼠脑白质差异蛋白质组学分析
材料与方法
1.本研究选取20只SD大鼠随机分为两组：对照组大鼠(Control组，10只)和T2DM大鼠模型组(T2DM组，10只)，两组大鼠分组喂养并利用高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲霉素建立T2DM模型(同第二部分)。
2.使用蛋白质非标记定量技术(Label-free)进行Control组和T2DM组脑白质差异蛋白质组学分析。筛选出可能与T2DM合并的WML发病相关的差异蛋白质，经生物信息学分析后，选取一些差异蛋白质进行Westernblot表达量验证。
3.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件，所有计量资料样本均数的离散趋势均用均值±标准差(-x±s)表示。两组间比较采用两独立样本均数的t检验，检验水准为α=0.05。不同样品组之间差异蛋白的筛选标准：FC＜-2.0或FC＞2.0且P＜0.05，视为差异蛋白。
结果
1.Control组和T2DM组大鼠脑白质蛋白经比较，共筛选到38种差异蛋白：24个蛋白表达上调，14个蛋白表达下调。
2.差异蛋白质主要分布在细胞膜、细胞质、外泌体和神经突触等，大多数是具有分子结合活性的蛋白，主要参与神经系统发育、对药物的反应、缺氧反应、负向调控神经细胞的凋亡以及化学突触传递等生物学过程。
3.差异蛋白主要具有EF-hand样结构域、EF-hand结构域、PDZ结构域、免疫球蛋白亚型2结构域和S100类钙结合蛋白结构域等。差异蛋白主要富集在4个KEGGpathway信号通路上。
4.差异蛋白以BDNF、NOS1、GAP43、SLC17A7、DNM1、GRM5和SLC1A2等蛋白为核心骨架，形成蛋白相互作用信息网络。
5.Westernblot验证，蛋白表达水平与蛋白质组学实验结果一致。
结论
1.在T2DM患者中WML与DACD明显相关。
2.WML在糖尿病前期及DACD发生前已经出现，随着WML加重DACD逐渐出现。在大鼠模型中右侧丘脑区WML与DACD明显相关。二甲双胍可能有减轻WML作用但是对DACD无明显影响。
3.利用Label-free技术能够有效的筛选出与T2DM大鼠WML相关的差异蛋白质，差异蛋白可能与神经突触传递或者神经系统细胞信号转导调控有关。