虽然目前药用肝素主要来源于猪小肠提取物,但是在历史上牛肺和羊小肠也曾是药用肝素的主要来源。20世纪90年代爆发疯牛病后,各国医药监管部门开始担忧动物源肝素的安全性,这种担忧在2007到2008年发生的肝素污染致死事件之后愈演愈烈。本论文采用现代多糖分析技术分别对猪、牛和羊来源的肝素进行了全面的物理化学特性分析。分析发现,不同动物源肝素在平均分子量、单糖组成、二糖组成、寡糖序列和抗凝血酶亲和能力方面存在差异。这些数据证明了三种不同动物源肝素存在差异,而由于牛羊肝素样品的缺乏,目前仍不能明确这种差异是固有差异还是由于生产工艺等因素引起的。但是通过对多种动物肝素结构的研究能够为生物工程肝素提供了必要的理论依据和研究方向。生物工程肝素项目(Bioengineered Research Project, BRP)是美国卫生院(NIH)和美国食品药品监督管理局(FDA)针对2008年发生的肝素钠致死事件发起的科研攻关项目。本论文为BRP项目的重要组成部分,负责对生物工程肝素的体外酶法合成展开探索性研究。应用肝素合成相关修饰酶和辅因子循环系统对100mg初始底物进行体外酶法催化,最终得到约3mg生物工程肝素终产物。应用现代多糖分析技术和体外生物活性分析方法对生物工程肝素终产物进行了结构鉴定和生物活性研究。结构鉴定结果表明生物工程肝素的二糖组成、3-O-sulfo四糖单元含量、三硫酸(Tri S)二糖单元含量和糖链结构与美国药典肝素一致,体外生物活性分析也表明生物工程肝素的抗凝血活性与美国药典肝素等效。研究结果有力得证明了生物工程肝素体外酶法合成和应用生物工程肝素替代传统动物源肝素的科学性和可行性。本论文随后对低分子量肝素的新型酶膜法降解进行了研究。由于酶解反应的高效性和专一性,肝素裂解酶易将底物降解为不具活性的二糖和四糖单元,破坏了肝素活性五糖结构,导致传统的酶法部分降解制备低分子量肝素(Tinzaparin,一种部分酶解商业低分子量肝素)产率低,产物生物活性偏低等问题。针对这一问题,本研究从肝素寡糖的膜分离特性入手,进而优化了如肝素降解酶类型、用酶量和超滤压力等酶膜反应条件,设计了一种酶膜反应器。反应条件优化研究发现,室温(22℃)、250mU肝素裂解酶和20psi氮气压力下,这种酶膜反应器制备产率达到最大(>80%)。进一步对产物的结构鉴定研究发现,由heparin lyase II降解得到的LMWH-II的平均分子量与商业LMWH接近,产物化学结构与肝素核心结构一致。最值得注意的是,该酶膜反应器制备的LMWH-II中不含有普遍存在于其它化学降解商业LMWH中的化学反应副产物。LMWH-II的抗凝血酶亲和能力、血小板因子4(PF4)亲和能力和体外抗凝血活性均与商业LMWH接近。最后,还对肝素的稳定性和构效关系进行了研究和探讨。肝素以及低分子量肝素生产过程(高温灭菌、酶法降解等处理)过程可能引起肝素中N-sulfo基团的流失而产生氨基类物质,这一结构变化将会影响肝素的抗凝血活性和货架期。本论文对美国药典肝素和热处理的美国药典肝素和低分子量肝素中的氨基衍生物定量检测方法进行了研究,开发了一种高灵敏度的亲和色谱质谱联用(HILIC-MS)分析方法。该方法应用heparin lyase将氘代乙酰化的肝素完全降解为二糖单元,随后运用HILIC-MS对降解得到的氘代二糖进行定量分析。该检测方法不仅检测灵敏度高,能够检测到自然丰度水平的氘代二糖含量,并且保持较小的检测误差和良好的重复性。这种同位素标记检测方法提供了一种理想的肝素稳定性研究和质量监控手段。通过表面等离子共振结合竞争实验还明确了N-sulfo基团的流失将引起肝素ATⅢ结合能力下降的这一构效关系。