创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种嗜温、嗜盐、嗜碱的革兰氏阴性海洋致病菌,广泛分布于河口、海洋,可通过皮肤伤口或肠道感染我国主要的养殖鱼类,致病力强、发病迅速且死亡率高,严重危害水产养殖业的发展。创伤弧菌的强致病性直接与其毒力因子相关,目前研究已发现的毒力因子包括溶细胞素、金属蛋白酶、荚膜多糖等。此外,研究发现创伤弧菌可以通过二型分泌系统分泌一种毒力因子磷脂酶VvPlpA,它以磷脂酰胆碱为特异性底物,在致病性中发挥着重要作用。在感染早期,创伤弧菌通过VvPlpA破坏宿主皮肤或肠道的上皮屏障,入侵组织和血管,催化水解产物还可以作为信号分子引发炎症,进而造成组织坏死和败血症。因此,关于创伤弧菌关键毒力因子VvPlpA的研究,对了解其致病机制和防治策略具有重要意义。通过比对VvPlpA的氨基酸序列发现,它与弧菌属一类胞外磷脂酶序列的相似度都在60%以上,是弧菌共有的热不稳定溶血素(TLH)家族蛋白,而TLH蛋白的分子结构目前均未得到详细的研究和报道;VvPlpA具有SGNH水解酶家族的典型序列特征,根据该序列特征可以确定VvPlpA的活性位点残基包括丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)以及组氨酸(His),其中Ser和His是主要的催化残基,通常协同位于His序列前的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu),以催化三联体的形式发挥水解功能。VvPlpA蛋白在此Asp/Glu位点的残基为Gly,显示出非经典三联体模式的序列特征。为深入探究TLH蛋白及非经典模式的催化三联体,更好地了解创伤弧菌致病机制与相应防治手段,本研究以创伤弧菌毒力因子VvPlpA为研究对象,通过结构生物学方法探究并分析其结构和功能的关系。本研究通过大肠杆菌原核表达系统获得硒代甲硫氨酸的VvPlpA重组蛋白,利用单波长反常散射法获取相位信息,解析了目的蛋白VvPlpA的晶体结构。VvPlpA的N端部分包含多个β折叠结构,具体功能目前未知;C端部分具有典型的α/β/α结构特点,属于SGNH水解酶家族的磷脂酶结构域。通过蛋黄平板和血平板定性实验,我们确定了纯化所得VvPlpA重组蛋白的磷脂酶活性和溶血性。为进一步验证VvPlpA中活性位点残基的关键作用,我们设计构建了对应位点的突变体蛋白,其中Ser152Gly,His392Asn及Asn247Asp表现出极低的催化活性,证明了这些活性位点残基在催化功能中十分必要。在VvPlpA活性位点His392与上述非典型残基的Gly389附近,我们发现了一个较弱的反常散射信号,推测该位置结合氯离子(Cl~-)。我们通过分子置换法解析了在溴离子条件下纯化和结晶的VvPlpA晶体结构,收集对应溴离子(Br~-)的反常散射信号,验证Br~-对Cl~-的取代,由此确定了Cl~-确实结合在VvPlpA蛋白的活性位点附近。我们利用突变体Gly389Asp模拟具有经典催化三联体的蛋白,测定VvPlpA与Gly389Asp在添加不同Cl~-浓度体系中的磷脂酶活性,结果发现野生型蛋白的催化活性伴随Cl~-浓度的升高而上升,直至达到饱和状态下的最大催化速率,Gly389Asp蛋白活性则不随Cl~-的浓度发生改变。由此说明Cl~-在VvPlpA催化功能中起到关键的作用,同时证明VvPlpA磷脂酶具有新颖的Ser-His-chloride催化三联体模式。为了解经典催化三联体和二联体在VvPlpA中可能的结构模式,我们解析了突变体Gly389Asp与Gly389Asn的晶体结构,其中氯离子的结合位置均被突变残基的侧链所取代,结构特点与催化活性一致。我们还发现突变体Gly389Asn的活性位点附近结合了一个六乙二醇小分子,显示出狭长的底物结合口袋,为探究催化过程中底物的进入和结合提供了重要的结构基础。