先天性心脏病(congenital heart disease.CHD)是胎儿时期心血管发育过程中相关基因异常而致的心脏血管畸形，可单独存在，也可作为复杂畸形的一部分。CHD是人类最常见的出生缺陷，同时也是儿童非感染性疾病的主要死亡原因，发生率约占活产总数的1-2％。在我国，每年有约15万患先天性心脏病的婴儿出生，而在西方国家先天性心脏病则是婴儿出生后第一年的主要死亡原因。尽管大多数常见类型CHD的心脏缺陷可以通过手术方式予以纠正，但手术治疗会给患儿家庭和社会带来沉重的经济负担；同时CHD患者术后发生心脏功能异常的几率与正常人相比会大大增加。　　 CHD是一种复杂的心血管系统发育异常性疾病，主要是由遗传因素和环境因素共同作用所致。其中遗传因素在CHD的发病过程中发挥着重要作用，遗传率为55%～65%。因其遗传方式、外显率等均不清楚，所以CHD致病基因尚未确定。近十年来随着分子生物学和分子遗传学技术的进展，人们对心脏发育的过程及其机制有了更深入的了解。　　 心脏发育不仅涉及不同时间、不同空间若干基因的先后表达，也涉及这些基因间复杂而精确的相互作用，其中任何一个基因表达质或量的异常都可能会影响心脏发育而导致CHD。当今心脏特异性转录因子成为研究热点，大量实验研究发现转录因子与CHD发生密切相关。模式生物研究证实心脏转录因子功能异常可导致严重的先心病，其基因突变是目前先天性心脏病发病机制研究的焦点。　　 TMST1是螺旋-环-螺旋转录因子(bHLH)家族的主要成员，在多细胞生物进化中高度保守参与胚胎发育及疾病的发生。在脊椎动物，TWIST1参与原肠胚及中胚层的发生。除此之外，TWIST1在哺乳动物心脏AV通道上皮细胞中被发现，研究证实TWIST1诱导上皮-间质细胞转化过程。鼠敲除模型，TWIST1()胚胎表现多种缺陷，包括头颅及心脏神经脊细胞的缺陷。因此，TWIST1在心脏神经脊细胞发生、转移及发育过程中起重要调节作用。　　 HHEX基因位于人类10q24，全长5.7 kb，包含四个外显子，编码270个氨基酸。同源盒基因HHEX表达于新生血管内皮细胞、心脏以及中胚层。同时，作为主要心脏决定因子HHEX基因参与控制早期心脏细胞的分化、迁移与发育；而且HHEX基因通过抑制作用参与心脏发生的诱导。　　 但迄今HHEX及TWIST1基因与CHD的关系还不确定，上述两者及其他转录因子与心脏发育之间的相互关系，转录因子之间的协调作用以及影响心脏发育的机制尚不明确，均需要进一步研究。本文旨在探讨先天性心脏病中转录因子HHEX及TWIST1基因突变情况以及二者基因突变对心脏形成的影响，将为CHD的早期诊断和治疗探索出新的途径。　　 第二部分 TWIST1基因突变与先天性室间隔缺损发病的关系及其功能的初步研究　　 目的：　　 探讨先天性室间隔缺损患者TWIST1基因突变情况；在体外初步研究TWIST1基因两个突变点的生物学功能。　　 方法：　　 选择196例先天性室间隔缺损患者及100例健康者，应用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)方法扩增TWIST1基因第1外显子编码区及两侧各50个碱基以上的序列，PCR产物纯化后经ABI PRISM3730全自动DNA测序仪自动测序，然后与NCBI数据库中TWIST1基因的序列进行比对，并与健康对照组比较，检测TWIST1基因突变情况。　　 用基因定点突变的方法，构建突变型真核PcDNA3.1-TWIST1表达载体，在体外和E-cadherin启动子luciferase报告质粒共转染293T细胞，48小时后利用双荧光素酶检测系统检测下游E-cadherin启动子-Luciferase报告基因的活性；构建突变型真核pCMX-GAL4-TWIST1表达载体，在体外和pCMX-VP16-PCAF、TK启动子luciferase报告质粒共转染293T细胞，48小时后利用双荧光素酶检测系统检测报告基因活性。　　 结果：　　 1、发现TWIST1基因2个新的杂合子突变，分别为p.Gly83 Ser和p.Ser95Gly。在NCBI的SNP数据库中均未见报道且在100例对照组中也未发现。　　 2、TWIST1基因编码的第83位甘氮酸和第95位丝氨酸在生物进化过程中均处于高度保守。　　 3、TWIST1基因杂合子突变p.Gly83Ser和p.Ser95Gly位于TWIST1基因N-端亲水基团，同时位于TWIST1与PCAF相互作用的区域。　　 4、突变型pcDNA3.1-TWIST1及突变型pCMX-GAL4-TWIST1真核表达质粒经测序验证构建成功。　　 5、TWIST1基因Gly83Ser突变型质粒激活下游E-cadherin luciferase报告基因的活性大约是野生型TWIST1质粒激活下游E-cadherin luciferase报告基因活性的3倍，具有显著性差异(t-test，p<0.01)；而TWIST1基因Ser95Gly突变型质粒激活下游E-cadherin luciferase报告基因的活性大约是野生型TWIST1质粒激活下游E-cadherin Iuciferase报告基因活性的1.6倍，具有显著性差异(t-test，p<0.05)。结果提示TWIST1突变体降低了TWIST1抑制E-cadherin的作用。　　 6、TWIST1基因Gly83Ser突变型质粒与PCAF相互作用后激活TK报告质粒的活性大约是野生型TWIST1质粒激活TK报告质粒活性的52%，具有显著性差异(t-test，p<0.01)；而TWIST1基因Ser95Gly突变型质粒与PCAF相互作用后激活TK报告质粒的活性大约是野生型TWIST1质粒激活TK报告质粒活性的77%，具有显著性差异(t-test，p<0.05)。结果提示TWIST1突变体降低了TWIST1与PCAF的相互作用。　　 结论：　　 1、转录因子TWIST1基因突变可能与中国散发型先天性室间隔缺损的发病相关。　　 2、应用基因定点突变的方法成功构建了 PcDNA3.1-TWIST1及Pcmx-GAL4-TWIST1突变型真核表达质粒。　　 3、在体外实验中，TWIST1基因Gly-83 Ser和Ser95Gly杂合子突变影响下游靶基因的转录活性；同时降低了TWIST1与PCAF相互作用，提示Gly83Ser和Ser95Gly杂合突变影响了TWIST1基因蛋白质生物功能。　　 第二部分先天性心脏病患儿HHEX基因的突变检测　　 目的：　　 探讨先天性心脏病患儿HHEX基因突变情况。　　 材料与方法：　　 选择296例先天性心脏病患者及200例健康者，应用聚合酶链反应(Polymerasechain reaction，PCR)方法扩增HHEX基因4个外显子编码区及两侧各50个碱基以上的序列，PCR产物纯化后经ABI PRISM3730全自动DNA测序仪自动测序，然后与NCBI数据库中HHEX基因的序列进行比对，并与健康对照组比较，筛察HHEX基因突变情况。　　 结果：　　 在本研究中未发现HHEX基因编码区有可能致病性的突变存在。　　 结论：　　 转录因子HHEX基因突变可能与中国先天性心脏病患儿发病不相关。