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沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,不仅能引起多种畜禽疾病(鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、猪副伤寒等),给养殖业造成严重经济损失,而且能够通过污染食物引起人类食物中毒,对人类健康造成严重威胁。目前,主要采用抗生素来预防和治疗沙门菌病,但由于抗生素的滥用和药物残留问题,严重影响养殖业的健康发展和公共卫生安全。因此,采用疫苗接种的方法来预防沙门菌感染显得尤为重要。但是,灭活苗需要经皮下多次接种,使用不方便,且不能诱导产生消化道局部保护力和细胞免疫,无法提供有效的保护效果。而弱毒活疫苗能够模拟自然感染状况,可以诱导细胞、体液和黏膜免疫,免疫力坚实,免疫期长。因此,利用基因工程技术构建基因缺失株,用作新型减毒活疫苗的研究备受关注。本研究调查了华东地区沙门菌流行情况,结果表明华东地区养殖场中沙门菌分布广泛,耐药性十分严重。然后,筛选合适的菌株,构建鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株SAT52AaroA-luxS,对其安全性及免疫效果进行评价,研制沙门菌基因缺失弱毒疫苗,为沙门菌病的防控提供参考。1.华东地区沙门菌的流行病学调查为了解华东地区沙门菌的分子流行情况,分别在上海、江苏、安徽、浙江等地养殖场采集样品285份,采用选择性培养基和PCR方法分离鉴定沙门菌,然后利用PCR方法检测沙门菌临床分离株的血清型及毒力因子,采用药敏纸片法检测其耐药性,并选取其中分离的7株临床株进行半数致死量(LD50)测定。结果共分离鉴定得到48株沙门菌,分离率为16.84%。血清学结果显示所检测的48株沙门菌中鼠伤寒沙门菌占64.58%;肠炎沙门菌占8.33%;其他血清型占27.09%。毒力基因检测发现除了sopE基因分布率为25%外,其它15个毒力基因分布率可达97%以上。LD50结果显示,7株临床分离的沙门菌LD50分别为 1.26×104CFU、1.26×104CFU、5.01×104CFU、5.01×104 CFU、5.01×104CFU、1.26×105 CFU、2.0O×1O5 CFU,证明沙门菌分离株对小鼠具有较强毒力。药敏试验结果显示沙门菌分离株对常见抗生素具有不同的耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、大观霉素、四环素、利福平、复方新诺明等抗生素的耐药率均超过50%以上。结果表明,鼠伤寒沙门菌在华东地区养殖场广泛流行,沙门菌分离株含有多个毒力基因,且存在多重耐药性菌株。2.鼠伤寒沙门菌aroA基因缺失株和aroA、luxS双基因缺失株的构建及生物学特性分析本研究通过Red同源重组技术,构建了 SAT52的aroA基因缺失株SAT52AaroA和aroA、luxS双基因缺失株SAT52AaroA-luxS,并对其生长曲线、运动性、生物被膜、HeLa细胞的黏附入侵能力等生物学特性进行研究。生长曲线结果显示,在对数生长期,基因缺失株SAT52AaroA和SAT52AaroA-luxS与野生株SAT52相比生长较慢,但差异不显著;其他时期SAT52、SAT52AaroA与SAT52AaroA-luxS的生长速度基本一致。生物被膜结果显示,基因缺失株SAT52AaroA和SAT52AaroA-luxS的生物被膜形成能力均显著低于野生株SAT52。运动性结果显示,与野生株SAT52相比,基因缺失株SAT52AaroA的运动性无明显变化,但基因缺失株SAT52AaroA-luxS的运动能力显著下降。细胞黏附入侵试验显示,与野生株SAT52相比,基因缺失株SAT52AaroA的入侵能力无明显区别,而黏附能力有所增强;基因缺失株SAT52AaroA-luxS的黏附能力无明显区别,而入侵能力有所增强。LD50结果表明,SAT52、SAT52AaroA和 SAT52△aroA-luxS 的 LD50 分别为 3.16×]04 CFU、1.78×107 CFU和4.22×107 CFU。双基因缺失株SAT52AaroA-luxS与野生株相比,其毒力降低了约1400倍,与单基因缺失株相比毒力降低2.4倍,表明缺失aroA、luxS基因可以显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。3.鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗株的安全性及免疫效果评价为了评价鼠伤寒沙门菌基因缺失株的安全性及免疫效果,本研究以6周BALB/c清洁级小鼠作为实验动物进行评价。免疫鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗后,以野生株SAT52攻毒,分析免疫保护率并确定最佳免疫剂量和保护持续期。然后,免疫鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗,不同时间点取小鼠脾脏,测定疫苗在体内的定殖清除情况。同时还进行动物体内传代试验,分析弱毒疫苗株是否返强以评价其安全性。结果显示,双基因缺失株SAT52AaroA-luxS免疫后有很好的免疫效果,可以刺激机体产生高水平的抗体,且免疫后6周、8周效价均能保持在一个很高的抗体水平。双基因缺失株SAT52AaroA-luxS以免疫剂量为1×106CFU/只免疫小鼠,其免疫保护期可达7周,因此最佳免疫剂量定为1×106CFU。在安全性方面,体内定殖清除结果显示,SAT52AaroA-luxS在脾内定植能力显著低于SAT52AaroA,免疫10天后即可完全清除。体内传代试验结果表明基因缺失疫苗株SAT52△aroA-luxS不易返强,安全可靠。因此,本研究构建的双基因缺失株SAT52△aroA-luxS具有优异的免疫保护效果且安全有效,可以用于防控鼠伤寒沙门菌的感染。