蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV),是一种以蜱为传播媒介的虫媒病毒,隶属于黄病毒科黄病毒属,共分为三个亚型,东欧亚型、西伯利亚亚型、远东亚型[1]。蜱传脑炎病毒的暴露极易导致蜱传脑炎的发生,蜱传脑炎是一种累及中枢系统的病毒感染性疾病。10%-20%的病毒感染患者会出现长时性或永久性神经系统损伤,预后不好。近年来,我国北部林区的病例报告数目持续增加[2]。埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是引起人类及其他哺乳动物致死性埃博拉出血热的病原体。埃博拉病毒隶属于丝状病毒科,埃博拉病毒属,分为五个亚型,分别为:扎伊尔型,苏丹型,科特迪瓦型,雷斯顿型和本地布焦型[3]。其中扎伊尔型及苏丹型对人类和非人灵长类动物的致病性和致死率很高。同时,引起此次2013-2015西非埃博拉出血热大暴发的也正是扎伊尔型埃博拉出血热,最终导致至少28638名疑似病例,11315病例确认死亡。因目前尚无特效的疫苗及治疗药物,世界卫生组织将其列为生物安全4级病原微生物[3,4]。中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-Co V),也被称为骆驼流感,是由中东呼吸综合征冠状病毒引起的病毒性感染性呼吸道综合征。发病症状严重程度从中度到重度不等,主要临床症状有发热,咳嗽,腹泻,气短等。疾病在免疫力低下及患有其他疾病的病人身上更为严重。目前,没有针对于此疾病的特效疫苗和治疗药物。截止2015年5月,已报道1000名病例,他们中的40%已经死亡。中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V),是β冠状病毒属的新成员,2012年第一次被报道,而就在2015年6月,全世界21个城市都出现了报告病例[5],其中包括英国、美国、韩国和我国的澳门,在一定程度上引起了大家的关注和恐慌。因此,病毒感染性疾病的早期诊断与及时治疗对患者的康复及预后都起着至关重要的作用。而病毒的检测则是疾病确切诊断的前提条件。目前,病毒感染的实验室及临床诊断检测方法主要有病毒细胞内培养、特异抗原抗体检测[6]、红细胞凝集反应和病毒核酸检测等等。近年来,随着聚合酶链反应技术的发展,核酸快速检测技术日臻完善[7-9]。实时定量聚合酶链反应是建立在聚合酶链技术基础上的一项分子生物学实验技术。它可以实现DNA模板扩增过程的全程可视化,而不是像传统聚合酶链反应一样,只能在反应结束后才可观察到结果。同时,实时定量聚合酶链反应可以实现对DNA模板浓度的定量。通常可以通过两个方法来实现:一种是在反应体系中加入与任一双链DNA都可以结合的非特异性荧光染料;另一种是设计标记有发光基团并可以与检测核酸特异性结果的探针,只在检测核酸存在的情况下与之结合。在病毒的核酸检测中,我们可以通过设计待检病毒的特异性引物、探针,实现病毒的快速检测及定量分析[10,11]。然而,病毒感染性疾病通常暴发于条件比较艰苦,缺乏实验室环境的偏远地区,这些地区一般无法提供实时定量聚合酶链反应所必须的仪器设备和试剂,这也体现出了实时定量聚合酶链反应的局限性。因此,我们试图寻找一种可以用于现场及非实验室环境下的快速核酸检测技术,以期它可以在现场及偏远地区进行病毒核酸快速检测。重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种新型等温核酸扩增技术[12-14]。在37-42℃条件下,10-15min能够完成核酸的扩增。在这种新型的等温核酸扩增体系中,重组酶体系帮助单链引物与DNA双链模板中的互补序列结合,启动核酸扩增过程,无需解链、退火过程,因此实现核酸的等温扩增。同时,通过T4噬菌体uvs X蛋白与ATP的结合与释放,建立动态反应环境,来平衡单链引物复合体与新合成核酸,达到整个反应的持续指数扩增。经探索,发现在体系中加入逆转录酶可以实现一步法RNA扩增,利于RNA病毒核酸扩增。核酸扩增完成后,我们可以通过琼脂糖凝胶电泳的方式观察结果,也可以通过向反应体系加入一条特异性荧光探针的方法,来实现实时观察。因此我们可以通过检测样品中目的核酸片段,来进行相应的病毒检测。由于是等温扩增技术,因此免去了聚合酶链技术中循环变温加热器等大型设备的使用。这些优点使得利用重组聚合酶扩增技术建立快速、低耗的现场病毒核酸检测技术成为可能。RPA技术在2006年由剑桥大学的Olaf Piepenburg、Colin H.Williams、Derek L.Stemple等人建立,仅有约10年的发展历史,是一项较新的等温核酸扩增技术,该技术很好地解决了在缺少大型温度调节设备或者现场环境下无法进行核酸扩增及后续分析的难题。仅需利用一台1kg的荧光检测仪配备笔记本电脑即可实现核酸扩增的实时观察或利用37-42℃恒温箱配备胶体金试纸条实现病毒检测。装甲RNA病毒样颗粒(armored RNA virus-like particle)技术是一种RNA阳性对照品制备技术。利用该技术制备出的阳性对照品中含有检测目的片段的RNA序列,相比于灭活病毒更安全,相比于质粒对照品更能准确反映检测体系。它的原理是利用基因工程方法将大肠杆菌MS2噬菌体外壳蛋白基因序列、检测目的片段基因序列克隆到表达载体上。载体通过逆转录将目的片段逆转录为RNA,同时表达出MS2外壳蛋白,将逆转录的RNA包裹装配成球形病毒样颗粒。这样的病毒样颗粒保护了其内部的RNA免受RNase的破坏[9,15-19]。本研究利用RPA技术建立蜱传脑炎病毒,扎伊尔型埃博拉病毒,中东呼吸综合征冠状病毒三种RNA病毒核酸快速检测方法,并通过与实时定量PCR相比较的方式验证了所建立检测方法的灵敏度和特异性。第一,在蜱传脑炎病毒RPA检测方法的建立中,针对于病毒序列3’非编码区保守序列进行引物、探针设计;建立了两步法RT-RPA检测方法;利用三种逆转录酶建立了两步法RT-q RPA检测方法并进行了检测体系的优化;利用五种逆转录酶建立一步法RT-q RPA检测方法并进行了检测体系的优化;并利用活病毒及本研究中制备的阳性对照品对所建立的检测方法进行了灵敏性验证,同时利用黄病毒属其他病毒的RNA对检测方法的特异性进行了验证;最后,利用本研究中建立的一步法RT-q RPA检测方法对54份蜱传脑炎疑似临床样本进行了检测,同时利用RT-q PCR检测方法检测了此批样本,对两者检测结果进行比较。第二,在扎伊尔型埃博拉病毒RPA检测方法的建立中,针对于病毒序列NP蛋白保守序列设计引物、探针;建立了两步法RT-q RPA检测方法;利用阳性质粒验证检测体系灵敏度;利用出血热症候群病毒RNA对检测体系进行了特异性验证。第三,在中东呼吸综合征冠状病毒RPA检测方法的建立中,分别针对于病毒序列开放阅读框5与E蛋白之间的序列(up E)及N蛋白序列的保守区域设计了两对引物、探针对;利用两种逆转录酶建立一步法RT-q RPA检测方法;制备了针对于两个不同检测目的片段的两个阳性对照品;并利用该阳性对照品对检测方法的灵敏度进行了验证;利用其它病毒RNA及SARS冠状病毒阳性质粒及本研究中建立的阳性对照品验证该检测方法的特异性。建立的两步法TBEV RT-q RPA检测体系灵敏度可达10-2TCID50;一步法TBEV RT-q RPA检测体系灵敏度可达10-2TCID50,1.8拷贝/体系;54份蜱传脑炎临床疑似样本检测结果显示与现行RT-q PCR检测方法检测结果相比较,没有统计学差异,表明检测体系可靠。建立的两步法ZEBOV RT-q RPA检测体系灵敏度可达100拷贝/体系。一步法MERS-Co V-up E RT-q RPA检测体系灵敏度可达4拷贝/体系;一步法MERS-Co V-up E RT-q RPA检测体系灵敏度可达1拷贝/体系。同时检测结果显示,所建立的检测体系特异性好,不发生交叉反应。本研究中,所制备的装甲RNA病毒样颗粒阳性对照品在电镜下可见直径25nm左右的球形颗粒。本研究建立了针对蜱传脑炎病毒的RPA快速核酸检测技术,经验证所建立的检测体系可以检测到浓度为10-2TCID50的活病毒,同时可以检测到单拷贝的含目的片段的阳性对照品,较针对于同一目的片段的RT-q PCR检测方法灵敏度高(10-2TCID50,380拷贝/体系)。此外,针对扎伊尔型埃博拉病毒、中东呼吸综合征冠状病毒,同样建立了RPA核酸等温扩增检测技术,分别可以检测到100拷贝、单拷贝的相应目的片段,其中MERS-Co V-up E RT-q RPA检测方法较针对于同一目的片段的RT-q PCR检测方法灵敏度高(RT-q PCR灵敏度为38拷贝/体系),其余几种与RT-q PCR灵敏度相同。本研究建立的所有的检测体系的特异性好,不与其他病毒核酸发生交叉反应。有望用于偏远地区及现场快速核酸检测。