论文部分内容阅读
恶性肿瘤具有六大特征,是在肿瘤逐步形成过程中构建的,它们是自给自足生长信号(Self-Sufficiency in Growth Signals)、抗生长信号的不敏感(Insensitivity to Antigrowth Signals)、抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)、潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)、持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)、组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)。这些特征构成的基础是基因组的不稳定所引起基因的多样性及变异性,进而促进肿瘤的发生及发展。肿瘤转移过程是多步骤,不连续的,可称之为浸润-转移级联反应,其中涉及很多基因学方面的改变。近10来,关于这方面的研究,已经积累了很多的经验,采用很多重要研究方法及工具。伴随着人类基因组计划的完成,各种基因的筛选已成为目前基因研究的热点,而探索肿瘤进展和转移的相关基因对判定肿瘤的预后、指导治疗措施的选择及研发新的治疗措施和方案都具有重要的指导意义。目的此前,本课题组对102例原发性肝细胞癌组织进行研究发现SATB1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,与肿瘤分级、分化及转移有关,影响肝癌患者的预后。为此我们在体外培养的细胞株中研究不同转移潜能的肝癌细胞株SATB1的表达状态,探索其与HCC侵袭转移的关系。方法选择五种不同侵袭潜能的肝癌细胞株(HepG2、SMMC-7721、 MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3),作为研究对象,以人永生化肝细胞株HL-7702作为对照。动物实验证实,将细胞株MHCC97H、HCCLM3接种到裸鼠体内,其肝癌肺转移的机率为100%,MHCC97L的肺转移率为40%。采用realtime fluorescence quantitative PCR、RT-PCR方法对六种细胞株SATB1mRNA表达水平进行分析,并以2-△△CT相对定量方法处理realtime fluorescence quantitative PCR所得数据；采用Western blotting分析六种细胞株SATB1蛋白表达水平,用ImageJ软件测量蛋白条带光密度值；采用免疫荧光方法对SATB1在细胞内的表达进行定位及定性分析,并用激光共聚焦显微镜采集图片。结果Realtime fluorescence quantitative PCR结果显示：相对于人永生化肝细胞株HL-7702,SATB1mRNA在5种肝癌细胞株中都有较高程度的表达,其表达水平因细胞株侵袭性不同而异(F=15.90,P<0.001)。其中高转移潜能的肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97HSATB1mRNA呈现高表达,相对表达量分别为5.31±1.40、5.65±1.28(P=0.604),低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L SATB1mRNA呈现较低表达,相对表达量为3.91±0.70,无转移潜能的肝癌细胞株HepG2、 SMMC-7721SATB1mRNA表达水平最低,相对表达量为2.40±0.60、2.53±0.72((P=0.846)。高转移潜能的肝癌细胞株SATB1mRNA表达水平,相当于无转移能力肝癌细胞株2.35倍。RT-PCR图片未见含有杂带非特异性扩增的现象,GAPDH条带均一。从条带趋势结果分析,在转录水平,不同侵袭潜能的肝癌细胞株SATB1mRNA表达水平差异大。随着细胞株侵袭性的增加,其相应图片扩增条带亮度增强,说明表达水平增高。Western blotting分析细胞株之间SATB1蛋白水平表达差异,胶片扫描仪采集图片。Image测量蛋白条带光密度值,并分别以HL-7702、HepG2、SMMC-7721、 MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3目的条带与内参条带光密度值的比值作为蛋白相对表达量,依次为0.180±0.002；0.271±0.002；0.351±0.023；0.621±0.026；0.878±0.026；1.236±0.006。结果显示不同细胞株SATB1蛋白表达水平均有显著差异,且伴随细胞侵袭力增强而增高(F=3.102×103；P<0.001)。其中侵袭能力较强HCCLM3细胞株SATB1蛋白表达水平是最高的,为无侵袭性细胞株HepG2的4.6倍(P<0.001)。应用Immunofluorescence方法对SATB1在HL-7702、HepG2、SMMC-7721、 MHCC97L、MHCC97、HCCLM3六种细胞株的表达进行定位及定性分析。SATB1与荧光素标记二抗反应后呈现为颗粒状红色荧光可判断为阳性染色。结果显示每种细胞株胞浆及胞核内都可见不同程度阳性染色,且分布规律有所不同。高侵袭性细胞株HCCLM3、MHCC97H无论是在胞浆还是胞核内,SATB1都显示强阳性染色；低侵袭力MHCC97L染色强度较低,主要在胞浆内分布,细胞核无染色；无侵袭性细胞株HepG2、SMMC-7721胞浆内染色强度弱,细胞核内没有染色。人永生化细胞株HL-7702胞核内无染色,胞浆呈弱阳性。结论体外HCC细胞株水平研究显示,SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株中的表达有差异,高侵袭性的细胞株表达水平最高,其与肝癌转移密切相关。结合此前在肝癌组织的研究,可推测上调SATB1表达可能促进肝癌转移,与肝癌术后复发密切相关。抑制SATB1表达,能否逆转肝癌细胞侵袭性,降低肝癌转移率,值得进一步研究。