【摘 要】
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p-葡萄糖苷酶催化p-葡萄糖苷键的水解及其逆反应,在能源、食品及医疗等领域有着广泛的应用前景。但是,p-葡萄糖苷酶的水解产物葡萄糖能强烈抑制p-葡萄糖苷酶的活性,阻碍了其在工业上的应用。在已被研究的β-葡萄糖苷酶中,只有少数几种是葡萄糖耐受型p-葡萄糖苷酶,且均来源于真菌,表达量很低,不能大量生产。因此,寻找高表达量的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶以满足工业化要求就显得至关重要。我们从根瘤农杆菌LBA
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p-葡萄糖苷酶催化p-葡萄糖苷键的水解及其逆反应,在能源、食品及医疗等领域有着广泛的应用前景。但是,p-葡萄糖苷酶的水解产物葡萄糖能强烈抑制p-葡萄糖苷酶的活性,阻碍了其在工业上的应用。在已被研究的β-葡萄糖苷酶中,只有少数几种是葡萄糖耐受型p-葡萄糖苷酶,且均来源于真菌,表达量很低,不能大量生产。因此,寻找高表达量的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶以满足工业化要求就显得至关重要。我们从根瘤农杆菌LBA4404中克隆p-葡萄糖苷酶基因bg1,将其构建在表达载体pET-28b（+）上,转化Escherichia coli RP（DE3）, IPTG诱导表达。粗提液中重组p-葡萄糖苷酶的比活高达36.7μmol/（min-mg）。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现：该酶是糖基水解酶家族1的成员,底物亲和力高,专一性低,在温度为40℃和pH在5-8之间时具有较高的酶活,在40℃以下和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物,该酶最适pH为6.4,最适温度为60℃,Km为0.09mmol/L,该反应体系中竞争性抑制剂葡萄糖酸-6-内酯的Ki为0.03mmol/L,葡萄糖的Ki为75 mmol/L,具有很高的葡萄糖耐受性,当金属离子Ag+和Zn2+存在时,酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。本研究在原核细胞中寻找到了高表达量的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶,为寻找能被高表达的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶提供了新的思路,具有重要的指导意义。
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