精神分裂症(schizophrenia, SCZ)是一种迁延终生,难以治愈的重大精神疾患,严重影响患者的生活质量。流行病学调查显示约1%的世界人口患有精神分裂症,给家庭和社会带来沉重负担。SCZ的主要临床症状包括幻觉、妄想、狂躁亢奋等阳性症状；情感淡漠、社会交往缺陷甚至社会退缩等阴性症状；以及注意力不集中等认知功能损害。阴性症状病程隐匿持久,常成为SCZ某一阶段最重要的症状,是预测SCZ严重程度的最显著指标,也成为SCZ研究的关键点和难点。SCZ的致病机制复杂,目前的主流观点认为,SCZ是遗传、环境和社会心理因素及其交互作用的结果。近年来,越来越多的证据显示神经发育,尤其是皮层的发育异常是SCZ重要的致病因素。多数SCZ患者早在幼年时期就已出现轻微的精神和行为异常；胚胎、婴幼儿期神经损伤及负性刺激常引起成年SCZ；起源于神经外胚层的颜面部微小躯体异常与SCZ密切相关。这些证据都提示了精神分裂与神经发育有关。在脑皮层结构中,额叶皮层占据体积最大,在进化上最新,负责认知、情感、语言和社会交往等高级神经活动。一般认为,思维贫乏、情感淡漠和社会交往缺陷等阴性症状定位于脑额叶。神经病理学的研究证实SCZ患者在儿童早期即存在脑皮质变薄、神经纤维联系减少等形态学改变；干预实验动物皮层发育可以导致SCZ类似症。这些证据则揭示了皮层发育异常是精神分裂的重要致病因素。据此,神经学者提出了神经发育假说,在脑发育期,来自遗传、环境或其他因素的影响干扰了神经元发育成熟、突触建立的发育轨迹,由此导致皮层的神经环路结构和功能伤害在青春期及成年期逐渐显现神经和精神症状。目前,从神经发育角度揭示SCZ致病的分子机制已成为研究热点。SCZ的发病与多种神经递质有关,如多巴胺(dopamine, DA),谷氨酸(glutamate, Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GAB A)等,并由此提出多种SCZ病因学说。过去数十年的研究发现,DA功能亢进虽可较好的解释SCZ阳性症状,但难以阐明其阴性症状。近年来,基于N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体功能低下导致的Glu功能紊乱学说逐渐引起学者关注。该学说较好的解释了SCZ阳性和阴性症状以及SCZ的进展演变过程。多种NMDA受体抑制剂,如地佐环平(dizocilpine, MK-801),苯环己哌啶(phencyclidine, PCP)等,可使健康志愿者产生SCZ症状。因此,NMDA受体抑制剂,尤其是MK-801被广泛应用于SCZ动物模型的制作及研究。在这种动物模型上,不仅可诱导出刻板行为、自发活动加强,还可检测出记忆障碍及社会交往行为减少等表现,较好的模拟了SCZ患者阳性及阴性症状。同时,在模型动物前额叶还检测到神经元损伤、神经突起数目减少等形态学改变、以及兴奋性和抑制性递质失衡。SCZ病人的尸检研究也发现额叶皮层神经元形态改变,包括树突棘密度降低、突起长度以及突起数目均明显减少。以上证据支持NMDA受体阻断剂诱导动物模型与SCZ之间有较好的吻合性。NMDA受体在脑发育过程中发挥着重要作用,其表达高峰期也是脑内神经元生长及突触联系建立的关键期。啮齿类动物则在生后脑内NMDA受体大量表达,并在第7天达到峰值。啮齿类动物脑的快速生长期也在生后14天内,表现为脑体积增大、伴随脑内过量神经元生成及自然凋亡,大量突触产生并选择性修剪。这一时期也是依赖NMDA受体脑发育的敏感期,在这一阶段阻断NMDA受体必然会干扰脑发育的正常轨迹,引发精神异常。因此,生后NMDA受体阻断建立的神经发育动物模型是建立在SCZ神经发育异常假说和谷氨酸功能紊乱学说基础上的最理想的研究模型,较成年模型而言,能更好的模拟SCZ。尽管已有关于SCZ发育模型脑递质代谢、认知障碍及病理学改变的报道,但幼鼠NMDA受体阻断后对额叶神经元兴奋性的影响尚不明确；发育模型鼠成年后精神症状,尤其是社会交往缺陷等阴性症状的行为学尚需进一步评价；新型非经典抗精神病药物的疗效也亟待阐明。微小RNA(microRNAs)是一类内源性小分子非编码RNA,可通过与靶基因3’非翻译区互补配对,在转录后水平抑制基因表达。已发现多数miRNAs与神经发育及神经精神源性疾病有关。miR-134是一种脑内特异性表达的microRNA,可调节树突棘的大小及形状,从而改变突触功能。在脑发育过程中,miR-134的表达与NMDA受体的表达峰值的时间和位置一致,并且NMDA处理可以导致神经元内miR-134表达上调。研究表明,精神分裂症患者背外侧额叶皮层miR-134表达上调,提示miR-134与患者认知障碍、社会交往缺陷等阴性症状有关。此外,miR-134的相关基因SIRT1也与神经发育及精神疾病相关。SIRT1是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,在胚胎神经管内高表达,可调节脑皮层神经元发育,减少神经元凋亡。SIRT1还与神经元兴奋性密切相关,其激动剂可增加神经细胞的兴奋性。单核苷酸多态性(SNP)研究也显示SIRT1与精神分裂症相关,并且NMDA受体阻断剂美金刚可以减弱谷氨酸导致的SIRT1表达异常。这些结果揭示了miR-134和SIRT1都与精神分裂密切相关,但是miR-134和SIRT1是否参与了MK-80I诱导的幼鼠脑皮层神经损伤以及由此导致的成年鼠社会行为缺陷,尚待进一步的研究。帕潘立酮是新一代的非经典抗精神病药物,能显著改善青年和中年SCZ患者的阳性和阴性症状,其中,改善阴性症状疗效更显著。临床研究也证实了帕潘立酮能明显治疗患者社会功能缺陷,疗效优于经典药物利培酮。近年来研究发现,帕潘立酮还具有直接的神经保护作用,可保护β-淀粉样蛋白损伤的SH-SY5Y神经细胞；降低多巴胺导致的SK-N-SH神经细胞中Caspase-3的蛋白表达水平。本实验室先前的研究也发现,帕潘立酮可体外保护损伤的神经元,但是,帕潘立酮对MK-801导致的幼鼠脑皮层神经损伤是否有保护作用,以及能否改善损伤幼鼠成年后社会交往缺陷尚未完全阐明。基于上述理念,我们设计了本项实验,分三部分：在细胞水平上,培养新生鼠原代脑皮层神经元,探讨MK-801导致神经元活性损伤和兴奋性降低的分子机制；在动物水平上,建立MK-801损伤幼鼠神经发育模型,利用脑片钳和新生鼠脑内基因电转技术分析MK-801诱导幼鼠额叶皮层神经元兴奋性变化及突触功能损伤的分子机制：从行为学变化上,通过MiceProfiler,一种新的视频分析软件,评价MK-801幼年损伤鼠成年后的社会交往行为缺陷,并均给予帕潘立酮处理,检测其治疗效果。第一部分：NIK-801诱导培养脑皮层神经元损伤的分子机制及帕潘立酮的神经保护作用首先,我们检测了MK-801对于原代培养脑皮层神经元活性的影响。取材并培养新生鼠脑皮层神经元,给予50、100和200μM浓度的MK-801处理,发现随浓度增加,神经元胞体逐渐变圆,突起缩短、断裂。CCK-8检测结果显示,MK-801导致细胞活性降低；乳酸脱氢酶LDH释放实验进一步显示MK-801致使LDH释放增多,导致细胞损伤。随后又在培养基内加入1、10和50μM的帕潘立酮,10μM的帕潘立酮可减轻神经元损伤,CCK-8与LDH检测结果显示细胞活性增加(P<0.05和P<0.01)。为检测培养神经元的兴奋性变化,我们使用单细胞膜片钳记录了细胞膜电位和诱发动作电位变化情况。使用100μM的MK-801处理后,神经元的的自发去极化完全消失,并且帕潘立酮不能改变MK-801的抑制作用；通过给予电流注射,检测诱发产生的动作电位,显示MK-801处理后,诱发电位幅度较对照组显著降低(P<0.01),而帕潘立酮可减弱MK-801的抑制作用(P<0.05)；为揭示帕潘立酮提高神经兴奋性的机制,检测了神经元Ih电流的变化,Ih电流是由钾离子内流产生的内向电流,可以调节神经元动作电位的产生。结果显示帕潘立酮处理组的Ih电流幅度明显小于MK-801处理组,有统计学差异(P<0.05),说明帕潘立酮可以抑制去极化电流,超极化膜电位。然后,我们分析了神经元损伤及兴奋性降低的分子机制。实时定量PCR显示MK-801抑制SIRT1表达并增加miR-134表达(均P<0.01)。给予10μM帕潘立酮处理可明显升高SIRT1表达并降低miR-134表达(均P<0.01)；Western blot显示帕潘立酮可升高SIRT1蛋白水平,与RT-PCR结果一致。最后,为进一步证实SIRT1/miR-134在帕潘立酮对抗MK-801导致神经损伤中的作用,我们先给予尼克酰胺抑制SIRT1活性,细胞活性结果显示抑制SIRT1活性后可减弱帕潘立酮的保护作用；沉默miR-134表达,可显著降低MK-801导致的细胞损伤作用。上述结果表明miR-134和SIRT1分子通路参与了帕潘立酮保护神经元、对抗MK-801诱导神经损伤的生物学作用。本部分结果显示,MK-801降低培养脑皮层神经元活性,诱导神经损伤,激活Ih电流降低神经兴奋性；帕潘立酮可抑制Ih电流部分恢复神经元的兴奋性,并通过调节SIRT1/miR-134分子通路发挥神经保护作用。第二部分：帕潘立酮对NK-801导致幼鼠额叶皮层神经元兴奋性降低的干预机制分析在上部分实验针对体外培养神经元研究的基础上,本部分实验应用MK-801皮下注射建立了SCZ神经发育动物模型,研究MK-801对幼鼠额叶神经元兴奋性损伤及帕潘立酮的干预作用。首先采用脑片钳技术记录了额叶皮层神经元白发动作电位和和诱发动作电位的变化。对照组可检测到稳定的自发动作电位,平均幅度为71.56±1.11mV,给予MK-801处理后,电位幅度迅速降为3.0-1.66mV,明显小于对照组(P<0.01)。在帕潘立酮处理组中,白发动作电位的幅度彻底恢复并跃升为74.14±10.23mV(P<0.01)。在MK-801损伤自发动作电位幅度近95%的情况下,帕潘立酮完全恢复白发动作电位幅度,甚至轻微高于对照组,说明帕潘立酮可显著增加自发动作电位的幅度,提高神经兴奋性。同样,相比对照组,MK-801降低了自发动作电位的频率(P<0.05),而帕潘立酮明显增加自发动作电位的频率(P<0.05)。然后,给予-200pA到200pA、每次10pA的步阶电流注射,分析了诱发动作电位变化,对照组诱发电位幅度为77.48±4.30mV；给予MK-801处理后,幅度明显降低(P<0.01)；在帕潘立酮组中神经元诱发电位幅度明显增加(P<0.05),恢复至对照组的92%,几乎完全恢复MK-801降低的电位幅度。同时分析了诱发电位的时程。实验结果发现；MK-801可增加诱发电位的时程(P<0.01),但帕潘立酮能逆转这种改变(P<0.01)。这些结果均表明MK-801通过阻断NMDA受体降低皮层神经元兴奋性,而帕潘立酮可完全逆转MK-801导致的兴奋性损伤。最后,我们还进一步研究了MK-801以及帕潘立酮对于额叶皮层突触功能的影响,发现了MK-801可以降低自发抑制性突触后电流(sIPSC)的幅度和频率(P<0.05和P<0.001),而帕潘立酮只能改变sIPSC的幅度(P<0.05),对于频率无明显影响。在第一部分的研究中,我们发现SIRT1/miR-134参与了MK-801对培养的脑皮层神经元的损伤,那么,SIRT1和miR-134是否参与了MK-801导致的神经元兴奋性损伤?为此,我们取模型鼠额叶脑组织经实时定量PCR检测了SIRTl和miR-134的表达变化。结果显示MK-801抑制SIRT1表达并升高miR-134表达水平(均P<0.05)；Western blot显示,SIRT1蛋白表达降低(P<0.05)；而帕潘立酮处理鼠中SIRT1表达升高并且miR-134的表达降低(均P<0.05)。SCZ发育模型鼠结果与体外培养的皮层神经元结果一致。为进一步验证SIRT1/miR-134分子通路在MK-801损伤幼鼠皮层神经元中的作用,我们使用了一种新的基因干扰技术：新生鼠脑内基因电转进行了后续的研究。合成SIRT1或miR-134的shRNA干扰片段,分别插入到到GV1 13的Agel, EcoRI和GV249载体的BamHI,HindⅢ酶切位点之间,构建GV113-shRNA-SIRT1和GV249-shRNA-miR-134干扰载体,通过ECM830细胞电穿孔仪在新生鼠脑内实施方波电转导入额叶皮层神经元,分别特异性沉默miR-134和SIRT1基因表达,然后采用脑片钳技术分别记录并分析GV113-shRNA-SIRT1和GV249-shRNA-miR-134干扰载体转染神经元的兴奋性变化。结果显示,SIRT1沉默后,诱发动作电位幅度明显低于对照组(P<0.01),但是动作电位的时程没有发生变化。这些结果与MK-801对于神经元的作用部分相似,证明MK-801对于神经元的部分作用是通过调节SIRT1实现的。在实验中我们还通过检测自发抑制性突触后电流(sIPSC)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的变化,进一步分析了神经突触功能变化及损伤情况。结果显示,GV113-shRNA-SIRT1转染神经元s1PSC的幅度(14.39±7.32pA)和频率(0.07±0.04Hz)均明显小于对照组(80.70±4.04pA和1.86±0.22Hz),并且具有明显差异(均P<0.001)。GV249-shRNA-miR-134转染神经元中,记录mEPSC幅度(9.82-±1.09pA)明显高于对照组(3.65±1.25pA),频率(2.64±0.26Hz)也高于对照组(0.81±0.21Hz),有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。上述结果显示,MK-801阻断幼鼠NMDA受体后,降低了脑皮层神经元自发放电的频率和幅度,降低白发动作电位的幅度和频率,并降低诱发动作电位的幅度,但增加时程延迟去极化恢复时间。新型抗精神病药物帕潘立酮可提高神经兴奋性,改善MK-801导致的神经元兴奋性损伤。通过新生鼠脑内基因电转技术,可靠的证实了帕潘立酮通过调节SIRT1/miR-134的表达来提高神经元兴奋性,并调节mEPSC和sIPSC改善突触功能。第三部分：NK-801损伤幼鼠成年后社会交往缺陷行为分析及帕潘立酮的治疗作用社会交往缺陷是精神分裂症重要的阴性症状,也是研究的难点。在第二部分实验分析了MK-801导致幼鼠额叶皮层神经兴奋性抑制的基础上,本部分实验旨在检测MK-801损伤幼鼠成年后社会交往行为的变化及帕潘立酮的治疗作用。在SCZ动物模型中,社会交往行为表现复杂且难以检测与分析。本实验采用了一种新检测分析技术,经视频记录通过MiceProfiler软件分析,可客观准确地分析动物自由活动、非标记状态下的社会交往行为。目前尚未见这方面的研究报道。为此,我们先检测了MK-801建立的成年SCZ模型鼠的的社会交往行为变化,一是评价MiceProfiler软件是否适用于SCZ的社会交往行为缺陷动物模型；二是检测帕潘立酮的治疗作用。成年鼠检测结果显示,SCZ模型鼠接触次数和接触时间较对照组明显减少(P<0.05和P<0.01),在动物交往最明显的前4min内,对照组接触次数为52.40±5.52次,明显高于MK-801处理组的23.80±2.13次(P<0.05),给予帕潘立酮治疗后接触次数增加至41.00±3.05次(P<0.05)；对照组小鼠的接触时间为40.82±6.24s,MK-801组明显下降为19.83±4.23s(P<0.01),给予帕潘立酮治疗后,可增加接触时间到32.42±.53s(P<0.01)。提示SCZ模型鼠社会交往行为减少,较好的模拟了情感淡漠的SCZ表现。MiceProfiler分析软件还精确的记录了动物间近距离位置事件(相互间距离小于3cm)和逃避行为。MK-801组近距离位置事件的次数和时间均较对照组明显减少(P<0.05和P<0.001)。SCZ模型鼠在同伴靠近时表现明显的逃避行为(主动远离靠近的同伴,避免接触),较正常鼠发生逃避行为的次数显著增加(P<0.05),暗示了SCZ鼠的社会退缩行为。令人兴奋的是,新型抗精神病药物帕潘立酮明显增加近距离位置事件(P<0.05),并减少逃避行为发生的次数和时长(P<0.05和P<0.01),显示出治疗SCZ阴性症状的良好效果。这些结果也表明MiceProfiler可以精确、客观的提取和分析实验动物多重模式的社会交往行为,并能检测分析SCZ模型鼠的社会交往缺陷。随后我们记录并分析了SCZ发育模型鼠成年后的的社会交往行为变化,先记录了4min,观察药物对于模型鼠的影响,随后又记录了4min,观察动物行为随时间的变化。首先分析了接触次数和接触时间,在0-4min和4-8min的两个时间段内,MK-801模型鼠的接触次数(21.40±5.22次和33.6+8.52次)均较对照组明显减少(58.80+7.46次和71.60±8.98次),并且具有明显的差异(P<0.001和P<0.01)；帕潘立酮治疗组明显的增加接触次数(38.23±5.23次和57.23±9.23次,均P<0.05)。但在0-4和4-8min内接触时间统计无差异。近距离位置事件结果也显示,0-4min内MK-801处理组近距离位置事件发生次数和时程明显低于对照组(P<0.01和P<0.05),而帕潘立酮只能增加近距离位置时间发生的时程(P<0.01)；4-8min内,MK-801处理组中只有发生次数降低了(P<0.01),帕潘立酮可以逆转此现象(P<0.01)。这些结果暗示MK-801显著诱导SCZ孤僻的阴性症状,模型鼠经MK-801处理导致接触次数和近距离位置事件发生的次数减少了,并且近距离位置事件时程部分减少。帕潘立酮可以部分增加近距离位置事件。随后,我们分析了模型鼠逃避行为,结果显示,在0-4min和4-8min的两个时间段内,MK-801模型鼠的逃避行为次数和逃避时间(11.6±0.98次和34.12±3.12s)比对照组显著增加(4.2±.15次和9.1±0.42s),并具有显著差异(P<0.01和P<0.001)。给予帕潘立酮处理后,0-4min逃避次数和时间明显低于MK-801处理组(均P<0.05)。4-8min也记录到了相同的结果,MK-801处理组的逃避次数和时间明显高于对照组,而帕潘立酮治疗可以减弱这种趋势。表明帕潘立酮可改善SCZ模型鼠的逃避行为。最后,应用Miceprofiler软件分析了停止行为,即动物交往中位置不变的行为。结果显示,MK-801模型鼠的停止行为次数明显少于对照组,从视频录像分析显示,动物的刻板行为增多,包括摇动前爪和相互理毛等,说明MK-801也可诱导出SCZ阳性症状。Miceprofiler可通过停止行为的检测反应部分模型鼠的阳性症状,但帕潘立酮没能改善停止行为的变化。本部分结果显示,MK-801损伤幼鼠成年后表现出明显的社会交往缺陷,接触次数及时间减少,近距离位置事件减少,逃避行为增加,模拟了SCZ情感淡漠、社会退缩的阴性症状。新一代抗精神病药物帕潘立酮可部分改善SCZ神经发育模型鼠成年后的阴性症状。同时,Miceprofile软件可客观、准确提取并分析SCZ发育模型鼠多重模式的社会交往行为缺陷变化。结论揭示精神分裂症的致病机制并寻找有效治疗方法一直是精神病学的研究热点。在幼鼠脑发育期阻断NMDA受体对皮层神经元活性、兴奋性及成年后社会交往行为的影响和相关机制尚不清楚。本项实验,首先,从细胞水平上,通过MK-801毁损原代脑皮层神经元细胞模型并给予帕潘立酮进行保护处理发现,帕潘立酮可通过上调SIRT1、降低miR-134表达对抗MK-801导致的神经损伤,提高神经元活性,并通过激活内向Ih电流增加神经元兴奋性。其次,从动物水平上,建立了MK-801损伤幼鼠SCZ发育动物模型,发现MK-801可减少额叶皮层神经元自发动作电位、诱发动作电位的幅度,抑制神经兴奋性,帕潘立酮可明显增加自发及诱发电位幅度,提高神经兴奋性。通过新生鼠脑内基因电转导入shRNA干扰载体,分别沉默SIRT1和miR-134基因表达,可靠地证明了SIRT1/miR-134分子通路参与了MK-801导致的神经兴奋性及突触功能损伤。最后,从行为学分析上,我们使用基于视频的社会交往行为分析软件MiceProfiler分析了MK-801损伤幼鼠成年后的社会交往缺陷表现,并发现帕潘立酮可有效改善MK-801诱导的社会交往缺陷。综上,本研究课题初步探讨了NMDA受体阻断剂MK-801导致幼鼠脑皮层神经元损伤及可能的分子机制,检测了幼鼠成年后社会交往缺陷行为变化,并分析了帕潘立酮的治疗作用,为揭示精神分裂症的发病机制及有效治疗提供了一个新的思路。