论文部分内容阅读
植物内源免疫是植物为了识别并抵御病原菌的侵袭而形成的一套多层次的复杂的防御系统。AtDNDl (defense no deathl, dndl)/AtCNGC2(cyclic nucleotide-gated ion channel2, CNGC2)和AtDND2/AtCNGC4是属于近年来发现的在动植物细胞中普遍存在的阳离子通道蛋白环核苷酸门控通道家族成员。研究表明,多个CNGC基因参与植物内源免疫反应, AtDND1/AtCNGC2和AtDND2/AtCNGC4被证明在植物过敏反应中起重要作用。为了更好地掌握AtDNDl/AtCNGC2和AtDND2/AtCNGC4在植物内源免疫中的作用,本实验对其进行克隆并构建了过量表达载体,同时克隆了DND1启动子序列并完成了DND1组织及亚细胞定位表达载体的构建,为研究其功能、组织及亚细胞定位奠定了基础。具体包括以下几点：(1)通过反转录PCR,从拟南芥中克隆出DND1(2181bp)和DND2(2085bp)。测序结果分别显示与NCBI所登陆的基因100%同源。(2)将DND1和DND2基因分别正向插入双元载体pPZP221的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,构建成pPZP221-DND1和pPZP221-DND2植物过量表达载体,转化农杆菌,用于进一步的基因功能研究。(3)以拟南芥基因组DNA为模板,克隆出DND1启动子序列。测序结果显示与NCBI所登陆的基因100%同源。将其插入带有gusA基因的双元载体pORE R1中得到植物表达载体pR1-pDND1,转化农杆菌,用于进一步的组织化学定位。(4)通过反转录PCR,从拟南芥中克隆了不带终止密码子的DND1基因,测序结果与NCBI所登陆的基因99%同源。一个碱基发生改变,但编码的氨基酸序列没有发生变化。(5)将DND1启动子和不带终止子的DNDl基因顺序插入到带有标记蛋白可溶修饰型绿色荧光蛋白(soluble-modified green fluorescent protein, smGFP)基因的双元载体pORE R3中,构建了植物表达载体pR3-pDND1-DND1,用于进一步的亚细胞定位研究。