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背景:强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种主要累及中轴骨骼和肌腱附着点的慢性炎症性疾病,疾病终末期可发生脊柱强直畸形,严重影响患者生存质量。炎症是AS核心环节,控制炎症并防止致残是AS治疗的重点。炎症发生与辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)的分化及效应密切相关。Th17来源于初始CD4+T细胞(Naive CD4+T cell)的分化,能特异性分泌细胞因子分泌白介素17(Interleukin 17,IL-17),促进了炎症的发生。Th17分化与IL-17分泌受到转录因子维甲酸相关孤儿核受体γt(Retinoic acid receptor related orphan receptor,RORγt)的调控,RORγt在炎性细胞因子的刺激作用下,基因沉默被打破,促使初始CD4+T细胞产生向Th17分化,启动AS炎症环节。组蛋白甲基化修饰对Th17的分化起重要调控作用。Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是组蛋白甲基化修饰酶之一,其主要作用为沉默下游靶基因的表达。研究发现,EZH2可明显抑制Naive CD4+T细胞向Th1 7分化。EZH2沉默基因表达是通过特异性甲基化组蛋白H3K27位点,抑制下游靶基因转录而实现的。在RORyt的编码基因RORc的启动子区域存在着大量组蛋白H3K27位点,EZH2可催化H3K27甲基化修饰,抑制RORc基因表达,封闭Th17分化。通过上调EZH2的表达,维持RORc基因沉默,抑制Th17分化,可有效控制AS炎症的发生。苦参碱为苦参的有效单体,前期实验研究表明,应用不同浓度苦参碱单体体外干预AS患者PBMC,可抑制Th17分化,抑制AS炎症。雷公藤有效单体雷公藤甲素可通过调节组蛋白H3K27甲基化水平的表达,调控Th17分化,干预AS炎症。本研究在前期研究的基础上继续探索EZH2在AS患者中的表达状况及与Th17分化的关系,并探索中药单体苦参碱、雷公藤甲素干预控制AS患者Th17分化,控制AS炎症的组蛋白修饰机制。目的:探究AS患者组蛋白甲基化酶EZH2调控Th17分化机制;探索中药单体苦参碱及雷公藤甲素干预活动期AS患者PBMC EZH2及RORc表达,影响H3K27位点甲基化水平,调控Th17分化并控制AS炎症的组蛋白修饰机制。方法:1.选取活动期AS(AS-A)患者30例,稳定期AS(AS-S)患者15例,正常人(N)10例,梯度密度离心法分离血清及外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)。运用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测 N、AS-S 及 AS-A 组患者血清 IL-17 的表达情况;运用蛋白质印迹法(Western Blotting,WB)检测N、AS-S及AS-A组患者PBMCEZH2、H3K27me3、RORc的蛋白表达情况;运用实时荧光定量PCR(real-time quantative PCR)技术 N、AS-S 及 AS-A 组患者 PBMC 中 EZH2、RORc mRNA表达水平,并对AS-A组患者的EZH2、RORc表达进行相关性分析。2.体外分离并培养活动期AS患者PBMC,ELISA方法及CCK8法确定中药单体苦参碱及雷公藤甲素的最佳干预浓度。检测EZH2、H3K27me3、RORc的蛋白及mRNA表达水平,同期观察中药单体雷公藤甲素及苦参碱体外干预对活动期AS患者H3K27me3、EZH2、RORc及对Th17分化的影响。结果:1.活动期AS血清IL-17的表达较非活动期AS组显著升高(p<0.05),较正常组显著升高(p<0.05),非活动期AS组较正常组无显著差异;活动期AS组EZH2蛋白表达量及mRNA表达水平较非活动期AS组显著降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),较正常组显著降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),非活动期AS组较正常组无显著差异;活动期AS组H3K27me3蛋白表达较非活动期AS组显著降低(蛋白:p<0.05),较正常组显著降低(蛋白:p<0.05),非活动期组较正常组无显著差异;活动期AS组RORc mRNA表达水平较非活动期AS组显著升高(mRNA:p<0.05),较正常对照组显著升高(mRNA:p<0.05),非活动期AS组较正常组RORc mRNA表达无统计学意义(mRNA:p>0.05);活动期AS组RORc蛋白表达较非活动期AS组显著升高(蛋白:p<0.05),较正常组显著升高(蛋白:p<0.05),非活动期AS组RORc蛋白表达较正常组显著降低(蛋白:p<0.05);活动期AS组EZH2表达与RORc表达呈现显著负相关(p<0.05)。2.浓度确定:活动期AS-PBMC经不同浓度苦参碱干预24h后,100μg/ml浓度苦参碱刺激下IL-17分泌量显著下降,且细胞毒性较小,因此选用10μg/ml苦参碱浓度进行后续实验。活动期AS-PBMC经不同浓度雷公藤甲素干预24后,在25μg/ml浓度雷公藤甲素刺激下IL-17分泌量显著下降,且细胞毒性较小,因此选用25μg/ml浓度进行后续实验。3.经苦参碱干预后的活动期AS-PBMC中,EZH2蛋白表达及mRNA表达水平较干预前显著升高(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),H3K27me3蛋白表达较干预前显著升高(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),RORc蛋白表达量及mRNA表达水平较干预前显著降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05)。4.经雷公藤甲素干预后的活动期AS-PBMC中,EZH2蛋白表达及mRNA表达水平较干预前显著升高(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),H3K27me3蛋白表达较干预前显著升高(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05),RORc蛋白表达量及mRNA表达水平较干预前显著降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.05)。结论:1.活动期AS患者外周血单个核细胞存在组蛋白甲基化酶EZH2水平降低,H3K27三甲基化水平降低,可能介导RORc表达,促进Th17分化,导致AS炎症的重要机制之一。2.苦参碱及雷公藤甲素体外干预活动期AS-PBMC上调EZH2表达,上调H3K27me3表达,下调RORc表达,抑制Th17分化,可能是治疗AS炎症的有效药物之一。