论文部分内容阅读
鳜（Siniperca chuatsi）是我国名贵淡水鱼,其食性十分特殊,自开口起终生以活鱼虾为食,通常情况下拒食死饵或人工配合饲料。本课题组已有研究发现鳜驯食死饵与其记忆密切相关,相比初次驯化,再次驯化时鳜摄食死饵这一习性作为长期记忆得到了巩固,进而提高了驯化率。环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）作为细胞内多种信号通路的一个重要组成部分,在神经系统发育、抑郁、成瘾性、生理周期,特别是在长期突触可塑性和长期记忆形成过程中具有关键作用。为进一步探究CREB信号通路在鳜驯食记忆过程中的调控机理,本研究通过比较初次驯化和再次驯化后鳜脑组织中CREB上游关键因子的活化与去活化水平,筛选出鳜驯化过程可能涉及的激活途径;利用CREB上游关键因子的抑制剂处理鳜脑原代细胞,检测CREB的活化水平及其下游信号分子的m RNA水平,以期初步探索CREB参与调控鳜驯食记忆的作用机理,主要结果如下:鳜初次驯化和再次驯化后,检测脑中CREB通路上游相关信号转导蛋白的磷酸化水平发现:与初次驯化相比,再次驯化组鳜脑中细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII）的磷酸化水平显著升高（P＜0.05）,蛋白激酶A（proein kinase A,PKA）的磷酸化水平显著降低（P＜0.05）,表明鳜驯食记忆与CREB上游ERK和Ca MKII的活化以及PKA的去活化相关。检测鳜脑中雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）通路下游核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6,S6）的磷酸化水平发现:相较于初次驯化,再次驯化后鳜脑中S6的磷酸化水平显著升高（P＜0.05）,表明鳜驯食记忆激活了m TOR通路。为进一步研究鳜CREB发挥作用的下游信号因子,结合胶原酶消化法和机械吹打法分离出3月龄鳜脑细胞并建立稳定的鳜脑细胞模型,采用免疫荧光细胞化学技术鉴定脑细胞神经元纯度大于95%。用ERK抑制剂（U0126）、PKA抑制剂（AT13148）以及PP1抑制剂（Okadaic acid,OA）分别处理鳜脑细胞后,检测CREB活化水平、下游记忆相关基因及食欲相关基因的m RNA水平:（1）CREB活化水平:U0126处理鳜脑原代细胞后,ERK1/2及CREB的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）,说明CREB的活化水平受ERK调控;AT13148处理鳜脑细胞后,PKA的磷酸化水平显著降低（P＜0.05）,而CREB的磷酸化水平显著升高（P＜0.05）,说明PKA活性降低可能激活CREB通路。OA处理后,CREB的磷酸化水平显著升高（P＜0.05）,说明PP1活性降低会促使CREB磷酸化。（2）CREB下游记忆相关基因m RNA水平:CREB被激活后,原癌基因c-fos（proto-oncogenes c-fos,c-fos）、Fos相关抗原2（Fos-related antigen 2,fra2）、即刻早期基因zif268（immediate early gene zif268,zif268）和CCAAT增强子结合蛋白δ（CCAAT enhancer binding protein delta,c/ebpd）的表达水平显著升高（P＜0.05）,CREB被抑制后,c-fos、fra2、zif268和c/ebpd的表达水平显著降低（P＜0.05）,说明c-fos、fra2、zif268和c/ebpd表达水平与CREB的活化水平相关。此外,使用OA激活CREB后,突触结合蛋白-4（synaptotagmin-IV,syt IV）的m RNA水平显著升高（P＜0.05）,说明syt IV转录与pp1/CREB途径激活相关。AT13148激活CREB后,脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,bdnf）的m RNA水平显著性升高（P＜0.05）,说明bdnf的转录与PKA/CREB途径激活相关。（3）食欲基因m RNA水平:U0126处理后,刺鼠相关蛋白（agouti related peptide,agrp）和生长激素释放肽（growth hormone-releasing peptide,ghrelin）表达水平显著升高（P＜0.05）,说明ERK/CREB参与调控agrp和ghrelin的转录水平;OA处理后,阿片促黑色素原（pro-opiomelanocortin,pomc）和瘦素A（leptin A）表达水平显著升高（P＜0.05）,说明PP1/CREB参与调控pomc和leptin A的转录水平;AT13148处理后,pomc表达水平显著升高（P＜0.05）,leptin A表达水平显著降低（P＜0.05）,说明PKA/CREB参与调控pomc和leptin A的转录水平。研究结果表明不同途径作用于CREB均可调控鳜食欲相关基因的转录,继而可能影响鳜摄食行为。综上所述,鳜驯化过程中的记忆形成可能由CREB上游蛋白激酶ERK和Ca MKII的活化、PKA的去活化以及S6的活化共同调控,CREB激活可调节下游记忆基因及食欲基因的转录,进而影响鳜的驯化,该研究结果为鳜驯化提供一定的理论依据。