研究背景食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发生率居各种恶性肿瘤第七位,死亡率居第六。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最常见的组织学类型,全球超过一半的ESCC病例发生在中国。尽管临床上有针对ESCC的多种治疗方法,但晚期ESCC的5年总生存率仅为15%。放射治疗是ESCC一种重要的治疗方式,特别是对那些手术不可切除的晚期食管癌患者。遗憾的是,肿瘤细胞的放疗抵抗会导致ESCC的复发和治疗失败,大多数患者在病理缓解后仍有复发。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是一种肿瘤细胞亚群,具有很高的致瘤潜能和对传统抗癌治疗的耐受性,是多种恶性肿瘤难以治愈的根源。越来越多的证据表明,CSC可以促进ESCC的放疗抵抗和远处转移,从而导致ESCC的放射治疗失败和复发。因此,阐明ESCC中CSC调控的分子机制,找到有效的分子治疗靶点,对改善ESCC患者的治疗和预后具有重要意义。RSK4是核糖体s6蛋白激酶(ribosomal s6 kinase,RSK)家族成员之一,与机体多种生理功能密切相关,包括调节基因转录、调控细胞周期、参与细胞增殖分化以及肿瘤的发生发展等。与其他RSK家族成员较明确的生物学功能不同,关于RSK4在恶性肿瘤的表达和功能的报道比较有限且相互矛盾,甚至有报道称RSK4可能在不同的癌症类型中发挥不同甚至相反的作用。我们前期通过免疫组织化学的方法在多种肿瘤的组织芯片中筛查发现RSK4在ESCC中的表达水平显著高于食管正常上皮组织,提示其可能在ESCC的恶性进展中发挥了一定作用。但到目前为止,RSK4在ESCC中发挥的具体作用及其分子机制还不十分清楚,这正是本研究想要解决的问题。本研究将围绕RSK4在ESCC中的病理生理作用及其上下游调控的分子机制进行深入探讨,阐明RSK4在ESCC转移、放疗抵抗以及CSC特性维持中的重要生物学意义,为ESCC的临床诊治提供新的有效分子靶点。目的1.明确RSK4在ESCC中的表达水平及其与肿瘤转移和预后的关系;2.明确RSK4与ESCC放疗抵抗以及CSC之间的关系;3.明确RSK4在ESCC转移、放疗抵抗和CSC特性维持中的作用;4.阐明ESCC中ΔNp63转录调控RSK4表达的分子机制;5.阐明RSK4磷酸化GSK-3β,激活Wnt/β-catenin信号通路,从而影响ESCC恶性进展的分子机制;6.明确RSK4小分子抑制剂对ESCC转移、放疗抵抗和CSC特性的抑制效果,探索RSK4能否作为ESCC的治疗靶标。方法1.利用实时定量PCR、Western blot以及免疫组化等技术检测ESCC和对应癌旁正常食管上皮的RSK4 mRNA、蛋白表达水平及其与CSC标志物的关系;2.收集手术切除ESCC病例信息,分析RSK4表达与患者临床病理指标以及生存预后的关系;3.收集放射治疗ESCC病例信息,分析RSK4表达与放疗抵抗的关系;4.建立RSK4过表达和敲低的稳定ESCC细胞系,利用Transwell侵袭迁移、三维培养侵袭、体内肺转移等实验技术检测RSK4对ESCC细胞转移能力的影响;5.利用流式细胞仪以及Western blot技术检测RSK4对ESCC细胞CSC标志物表达的影响,利用成球实验和极限稀释裸鼠成瘤实验检测RSK4对ESCC细胞CSC特性维持的影响;6.利用辐射克隆形成实验以及测定细胞内Caspase-3活性检测RSK4对ESCC细胞放疗抵抗的影响;7.ESCC临床标本中分析ΔNp63与RSK4蛋白表达的相关性,利用染色质免疫共沉淀以及荧光素酶报告基因活性分析检测ΔNp63α对RSK4的转录调控作用;8.利用体外激酶实验、体外GST pull-down以及免疫共沉淀等技术检测RSK4对GSK-3β的磷酸化作用以及二者的相互结合;9.利用蛋白稳定性及泛素化实验、免疫荧光和Western blot等技术检测RSK4对β-catenin蛋白稳定性的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用;10.利用RSK4小分子抑制剂BI-D1870检测其对ESCC细胞系、裸鼠移植瘤和病人来源异种移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型的转移、放疗抵抗以及CSC特性的抑制效果。结果1.ESCC中RSK4的mRNA和蛋白水平较癌旁食管正常上皮升高,并且RSK4在ESCC CSC中可以富集,与CSC标志物ALDH1呈正相关关系;2.RSK4高表达与ESCC患者淋巴结转移、血管侵犯及较差的生存预后相关,多因素Cox回归分析发现RSK4是ESCC独立的预后影响因素;3.放射治疗可以诱导ESCC中RSK4的蛋白表达,高表达RSK4的ESCC患者与放射治疗抵抗有关,无病生存期较短;4.RSK4过表达能够促进ESCC细胞的侵袭迁移能力和体内肺转移潜能,敲低RSK4后ESCC细胞的转移能力降低;5.RSK4过表达能够提高ESCC细胞CSC标志物的表达水平,提高肿瘤成球能力和裸鼠体内成瘤能力,敲低RSK4后可以降低ESCC细胞的CSC特性;6.RSK4过表达能够促进ESCC细胞的放疗抵抗能力,降低辐射导致的细胞凋亡,敲低RSK4后可以提高ESCC细胞的放疗敏感性;7.ΔNp63和RSK4蛋白在ESCC中表达呈正相关关系,ΔNp63α能够结合到RSK4基因启动子的-644到-625区域,促进RSK4的转录激活;8.RSK4能够直接磷酸化GSK-3βSer9位点,并且GSK-3β能够与RSK4的N末端激酶活性区(N-terminal kinase domain,NTKD)结合;9.RSK4通过磷酸化GSK-3βSer9促进β-catenin蛋白的稳定性及核转位,进而激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达;10.RSK4的小分子抑制剂BI-D1870能够有效抑制ESCC细胞的转移能力和CSC特性,提高ESCC裸鼠移植瘤和PDX模型的放射治疗敏感性。结论1.RSK4在ESCC较正常食管上皮表达升高,且RSK4高表达与肿瘤的淋巴结转移和血管侵犯相关,并且是ESCC患者独立的预后因素;2.RSK4能够在ESCC CSC中富集,且与ESCC患者的放疗抵抗及CSC特性密切相关;3.RSK4能够促进ESCC细胞的转移潜能、放疗抵抗和CSC特性,为临床治疗ESCC提供了有效的分子靶点;4.RSK4是ΔNp63α的直接转录调控下游靶分子,ΔNp63α调控ESCC细胞的转移、放疗抵抗以及CSC特性需要依赖RSK4发挥作用;5.RSK4可以直接磷酸化GSK-3βSer9位点,激活Wnt/β-catenin信号通路,进而促进ESCC细胞的转移、放疗抵抗和CSC特性;6.RSK4的小分子抑制剂BI-D1870能够有效抑制ESCC细胞的转移能力和CSC特性,提高放射治疗敏感性,提示临床上BI-D1870联合放射治疗可以提高ESCC的肿瘤治疗效果。