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研究目的 晕船是一种常见的航海疾病,因晕船引起的头痛、头晕、恶心、呕吐、脑体功能急剧下降等严重影响海上作业能力。近年来,航海事业的发展使抗晕船成为航海医学中一个重要研究课题。随着人们对抗晕船药物中枢副作用的深入了解,晕船易感性预测逐渐受到重视。目前关于晕船易感性个体差异机理的研究报道较少,而且仅限于生理生化水平,从基因水平对晕船易感性机理的研究尚未见报道。人群中晕船易感性个体差异较大,人群调查结果显示晕船的个体差异与个体的性别、年龄、种族以及遗传因素有关,提示晕船易感性个体差异可能与基因的差异表达有关。现有的晕船机理研究表明脑干在晕船发生过程中发挥重要作用。因此本研究通过筛选和鉴定晕船易感大鼠脑干组织差异表达基因,并在此基础上进一步研究晕船时机体能量代谢相关基因的表达变化与产生晕船易感性个体差异的可能机制。旨在从分子水平探讨晕船易感性个体差异的机理,为最终建立晕船易感人群预测方法提供实验依据。 研究方法 1.建立晕船易感大鼠动物模型 SD雄性大鼠8只,体重150-180g,给予热暴露6天,根据大鼠热应激后肛温的变化判断其是否产生热适应。SD雄性大鼠30只,体重150-180g,给予模拟晕船刺激21天,根据大鼠异嗜高岭土量的变化趋势判断其是否对模拟晕船刺激产生适应。以热应激作为模拟晕船刺激的应激对照,在进行大鼠热应激和大鼠模拟晕船刺激实验前,比较两者异嗜高岭土量的差异,以及大鼠模拟晕船刺激适应前后和大鼠热适应前后异嗜高岭土量的差异。以证实异嗜高岭土是否是判断大鼠发生晕船的特异指标。 SD雄性大鼠100只,体重150-180g,随机等分为A组和B组。A组随机取出10只作为对照,不给予模拟晕船刺激,其余的40只全部给予模拟晕船刺激3天:B组随机取出10只作为对照,不给予模拟晕船刺激,其余的40只全部给予模拟晕船刺激21天。观察实验过程中各组大鼠异嗜高岭土量及异嗜高岭土量的变化第二军医大学博士学位论文趋势,以研究大鼠中晕船易感性个体差异情况。 根据是否异嗜高岭土及异嗜高岭土量的变化趋势对A组和B组的模拟晕船刺激大鼠进一步分组:A组大鼠分为晕船组和不晕船组;B组大鼠分为晕船易感组、晕船适应组和不晕船组。2.筛选晕船易感大鼠脑干差异表达基因 以B组中晕船易感大鼠为实验组(tester),以B组中不晕船大鼠为驱动组(driver),提取脑干组织RNA,利用抑制消减杂交技术(SSH)构建晕船易感大鼠脑干组织差异表达基因cDNA文库。以差异表达基因菌液为模板进行PCR扩增,检测是否含有插入片段以及插入片段长度。挑取含有插入片段的克隆进行斑点杂交筛选阳性克隆。阳性克隆的测序结果分别输入GenBank中进行同源性检索。对cDNA序列的初步分析以及氨基酸的翻译使用DNAssist version 2.0软件,蛋白质序列分析在~Softbe卿.com上进行。3.探讨能量代谢相关基因的差异表达与晕船的关系 提取A组的对照大鼠、晕船大鼠和不晕船大鼠脑干组织RNA,同时提取B组的对照大鼠、晕船易感大鼠、晕船适应大鼠和不晕船大鼠脑干组织RNA。以大鼠队action基因为内参照,利用实时荧光定量PCR技术,分别检测编码磷酸果糖激酶、Al,P合酶、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶和铁蛋白的基因在上述晕船差异个体脑干组织中的表达情况。研究结果1.晕船易感大鼠动物模型 大鼠接受热应激最初两天肛温在40℃以上,第三天开始肛温一直维持在39.5℃左右,这提示大鼠己经产生热适应。 在进行热应激和模拟晕船刺激实验之前,两组大鼠异嗜高岭土量差异不显著:在热应激和模拟晕船刺激期间,热应激大鼠较晕船大鼠异嗜高岭土量低,两者差异显著(p<0 .05);在大鼠对热应激和模拟晕船刺激适应后,两组大鼠异嗜高岭土量差异不显著。大鼠在热适应前后异嗜高岭土量差异不显著,但大鼠在晕船适应后较晕船适应前异嗜高岭土量明显降低,两者差异显著(p<0.05)。 大鼠接受模拟晕船刺激后,对照组和各实验组之间的进食量以及体增重差异不显著(p>0.05)。但不晕船组大鼠的进食量较其它各组的进食量相对稍高。在模拟晕船刺激前期,对照组大鼠的体增重较实验组大鼠的体增重略高。第二军医大学博士学位论文 A组40只实验大鼠给予模拟晕船刺激共3天。结果显示晕船组大鼠异嗜高岭土量显著高于对照组大鼠(P<0.05);对照组大鼠和不晕船组大鼠异嗜高岭土量差异不显著。 B组40只实验大鼠给予模拟晕船刺激共21天。结果显示,晕船易感大鼠(20%)在接受晕船模拟刺激的过程中异嗜高岭土量一直处于较高水平,与对照组比较差异显著(P<0.01或P<0.05);晕船适应大鼠(55%)在接受模拟晕船刺激后,异嗜高岭土量从较高水平逐渐降低到对照组水平,在刺激的前期异嗜高岭土量与对照组比较差异显著(P<0.01或P<0.05),到刺激的后期异嗜高岭土量与对照组比较差异不显著(p>0.05);不晕船大鼠(25%)在模拟晕船刺激过程中几乎不异嗜高岭土,异嗜高岭土量与对照组比较差异不显著(p>0.05)。 结果提示:异嗜高岭土是判断大鼠发生晕船的特异指标,大鼠中存在晕船易感性个体差异。建立的晕船易?