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鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属成员,该病毒主要侵害3周龄内的雏鹅和雏番鸭,故引起的疾病被称为小鹅瘟。该病最早见于我国学者方定一的报道,具有传播快、死亡率高的特点。3-20日龄的雏鹅和雏番鸭易感性高,死亡率可达90%-100%。发病日龄越小死亡率越高。鹅细小病毒基因全长约5kb,基因组包括左右2个开放阅读框,其中左侧开放阅读框编码非结构蛋白,包括NS1和NS2。其中,NS1基因由1 884个核苷酸组成。NS1在病毒的致病性、复制及调节表达方面发挥了重要的作用。NS1为磷酸化蛋白,同参与调节启动子的细胞因子结合,在鹅细小病毒DNA早期复制过程有多种功能;NS1可与病毒DNA复制起始序列高亲力结合,对病毒DNA的复制是必须的;NS1可抑制细胞DNA的复制且对衣壳蛋白的启动子起正调节作用,除此之外NS1可对P41启动子起负调节作用。目前国内外研究的热点主要集中在GPV结构蛋白,对于非结构蛋白的研究较少。本实验构建了NS1表达载体,开展了NS1蛋白与鹅胚成纤维细胞蛋白互作研究,旨在为阐明GPV病毒复制的分子机制提供科学依据。本研究共分为以下四个部分:1、鹅细小病毒梨树分离株的分离鉴定及其NS1基因序列测定与分析:采用鹅胚从吉林省梨树县疑似小鹅瘟死亡雏鹅的临床病料中分离到1株病毒,经电镜负染观察和GPV特异性PCR引物鉴定,证明所分离病毒为鹅细小病毒,命名为GPV/2010/LS株。扩增并克隆了GPV/2010/LS株非结构蛋白NS1基因。序列分析表明,该毒株NS1基因及其氨基酸序列与台湾分离株82-0321、上海分离株SHFX1201、扬州地区分离株YZ99-6和长春分离株CH同源性很高,且NS1基因相对比较保守。2、鹅胚成纤维细胞与GPV NS1蛋白互作蛋白的筛选及鉴定:利用Clontech公司的SMART技术,快速、高效的构建了鹅胚成纤维细胞cDNA文库。采用酵母双杂交技术,以非结构基因NS1为诱饵蛋白,成功构建重组载体pGBKT7-NS1,用该诱饵载体筛选构建了鹅胚成纤维细胞cDNA文库。利用多重筛选培养基SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA、SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA筛选出阳性酵母双倍体,拯救酵母双倍体文库质粒,送生物公司测序,并对测序结果比对分析。结果显示,构建了浓度为4×106 pfu/mL的鹅胚成纤维细胞cDNA文库。构建了重组载体pGBKT7-NS1,并表达和验证。从鹅胚成纤维细胞酵母双杂交文库中筛选出两种与鹅细小病毒NS1互作蛋白并测序,在线Blast鉴定为由411个碱基对编码的核糖体S12蛋白(命名GEF/2011/GP1)和由296个碱基对编码的未知蛋白(命名GEF/2011/GP2)。3、鹅胚成纤维细胞GP1和GP2与小鹅瘟病毒NS1相互作用的GST-pulldown验证:构建了pGEX-4T-1-NS1原核表达质粒,表达出95 kDa大小的NS1蛋白。构建了pcDNA-3.0-Flag-GP1和pcDNA-3.0-Flag-GP2两个真核表达质粒,并成功获得表达。利用GST-pulldown技术验证,GPV NS1蛋白能与鹅胚成纤维细胞GP1和GP2蛋白相互作用。为后期研究GP1和GP2在鹅胚成纤维细胞内外对GPV增殖的影响奠定了基础。4、与GPV NS1互作的鹅胚成纤维细胞蛋白对GPV增殖的影响:本实验已经通过GST-pulldown技术确定GPV与鹅胚成纤维细胞互作的GP1和GP2蛋白,为了进一步研究这两种蛋白对GPV的复制影响,我们进行了两方面研究。一是在GEF细胞外,LS株GPV与纯化后的GP1和GP2蛋白相互作用再感染GEF细胞,采用SYBR Green I法荧光定量检测手段检测GPV的增殖情况,判断该两种蛋白对GPV增殖的影响;二是在GEF细胞内,将含有GP1和GP2基因的真核表达质粒转染GEF细胞,同时感染LS株GPV,采用SYBR Green I法荧光定量检测GPV的增殖情况,判断GP1和GP2蛋白在细胞内对GPV复制的影响。测定了LS株GPV的TICD50,将病毒和GEF细胞比例MOI值确定为1。利用GST-pulldown技术将GST-GP1和GST-GP2蛋白分别纯化,测出GP1和GP2蛋白浓度分别为0.54μg/μL和0.38μg/μL。结果发现,在GEF细胞外,随着GP1和GP2蛋白含量的增加,GPV增殖的核酸拷贝数值逐渐变小,说明两种互作蛋白对GPV的增殖有抑制作用。在GEF细胞内,12 h后检测转染组和未转染组GPV核酸拷贝数,发现其无明显变化;转染和接毒24 h后检测发现,转染组和未转染组GPV核酸拷贝数值出现明显变化,即转染含有GP1真核表达质粒的实验组GPV的核酸拷贝含量是对照组(单独GPV感染GEF细胞)含量的2.6倍,转染含有GP2真核表达载体的实验组GPV的核酸拷贝含量是对照组(单独GPV感染GEF细胞)含量的0.3倍。同时,采用以Flag单克隆抗体为二抗的Western blot试验,证明转染两种真核表达质粒的GEF细胞表达了外源蛋白。分别单独和混合转染含有GP1和GP2真核表达质粒,同时接种GPV,24 h后检测发现,转染含有GP1真核表达质粒细胞组,GPV核酸拷贝数是对照组(含病毒和水)的1.89倍,是混合转染组的2.56倍,是GP2组的7.77倍。再次证明,在GEF细胞内,GP1蛋白对GPV增殖具有促进作用,GP2蛋白则相反具有抑制作用。从临床病料分离到1株病毒,命名为GPV/2010/LS株,扩增克隆NS1基因,序列分析表明NS1基因相对保守。NS1为非结构蛋白,在病毒的生活周期中起着十分重要作用。本实验构建了NS1表达载体,研究NS1蛋白与宿主纤维细胞蛋白互作,具有一定的意义。构建了鹅胚成纤维细胞cDNA文库,利用酵母双杂交技术,以非结构基因NS1为诱饵蛋白,从文库中筛选出与NS1互作蛋白核糖体S12蛋白(命名GP1)和由296个碱基对编码的未知蛋白(命名GP2)。研究S12蛋白对GPV复制的影响,对了解GPV的感染机制、致病机理等方面方面均有重要意义,为该病的防治能提供一定参考依据。